王書芳，程翼宇

(浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310058)

中藥化學(xué)物質(zhì)組成十分復(fù)雜，中藥產(chǎn)品藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制不明確是制約中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸?，F(xiàn)代儀器分析技術(shù)的快速發(fā)展不僅為中藥研究提供了機(jī)遇和新的方法，而且為實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化開辟了技術(shù)途徑，推動了中藥研究領(lǐng)域的學(xué)術(shù)創(chuàng)新和技術(shù)的跨越式發(fā)展。

1 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域

辨析中藥化學(xué)物質(zhì)組成是中藥現(xiàn)代化研究的基礎(chǔ)，也是研究中藥藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制的主要切入點。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的傳統(tǒng)方法是采用提取、萃取、柱層析或制備型液相色譜等手段獲得中藥所含的單體化合物，進(jìn)而用核磁共振或紅外光譜等儀器鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。然而，這類分離分析方法耗時耗力、效率低下，當(dāng)中藥成分微量時難以得到足量化合物用于鑒定結(jié)構(gòu)，而中藥，特別是中藥方劑往往含有近百種甚至幾百種以上的微量成分。因此，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及液相色譜-核磁共振聯(lián)用(LC-NMR)等快速鑒定方法應(yīng)運而生，其為辨析復(fù)雜中藥的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)提供了先進(jìn)手段。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的新技術(shù)還有二維色譜和擴(kuò)散排序核磁共振法。

1.1 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 常用的色-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)，其特點是將色譜高效分離能力與質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)鑒定能力相結(jié)合，可快速分辨中藥化學(xué)物質(zhì)。GC-MS從上世紀(jì)60年代發(fā)展至今，技術(shù)方法相當(dāng)成熟，NIST質(zhì)譜庫已收錄了147 000余種化合物的質(zhì)譜圖。根據(jù)GC-MS分析數(shù)據(jù)可從庫中搜索匹配相應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)，該技術(shù)常用于定性分析中藥的揮發(fā)性成分或經(jīng)衍生化后可揮發(fā)的成分;近年出現(xiàn)的氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(GC-TOF-MS)技術(shù)，能提供化合物的準(zhǔn)確分子量，使結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果更加可靠。LC-MS分析技術(shù)始于上世紀(jì)70年代，常用于中藥的不揮發(fā)性或熱不穩(wěn)定成分分析，其分離效率雖比GC低，但適用對象更廣，是目前發(fā)展最為迅速的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。這類技術(shù)的發(fā)展趨勢是液相色譜與復(fù)合型質(zhì)譜聯(lián)用，如四級桿-飛行時間質(zhì)譜(Q-TOFMS)、四級桿-線性離子阱質(zhì)譜(Qtrap-MS)、離子阱-飛行時間質(zhì)譜 (IT-TOFMS)、線性離子阱-靜電場軌道阱質(zhì)譜(LTQOrbitrap-MS)、線性離子阱-傅立葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜(LTQ-FT-ICR-MS)等。這些復(fù)合型質(zhì)譜將不同類型的質(zhì)譜串聯(lián)起來，以提高分辨率、檢測靈敏度及質(zhì)量測定準(zhǔn)確度等，或者增強(qiáng)其定量能力，在一臺質(zhì)譜儀上實現(xiàn)定量和定性分析。超高效液相色譜(UPLC/UHPLC)或快速分離液相色譜(RRLC)是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，比普通HPLC的分離效率和檢測靈敏度更高，分析速度更快，其較低的流速使得質(zhì)譜離子化效率提高、基質(zhì)效應(yīng)降低，與質(zhì)譜聯(lián)用優(yōu)勢明顯。

1.2 二維色譜技術(shù) 對于化學(xué)組成復(fù)雜、類別差異大的中藥，僅用一種分離方法往往不易分離。二維色譜將兩種不同的分離方法聯(lián)用，以提高其分離力、增加色譜的峰容量。Wu等建立了用陽離子交換色譜與反相加壓毛細(xì)管電色譜結(jié)合的二維分離平臺，采用三種分離原理分析了中藥材黃柏。

1.3 LC-NMR和LC-NMR-MS技術(shù) 在確定化合物結(jié)構(gòu)的定性分析方法中，核磁共振譜(NMR)是最強(qiáng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)之一，但是其靈敏度較低，實現(xiàn)LC-NMR定性分析的難度較大，不僅LC洗脫液對NMR測定有影響，而且LC流速快，與NMR測定所需時間難以匹配。而傅立葉變換核磁共振儀和脈沖序列的發(fā)展為解決上述問題提供了可能。由于NMR對C的靈敏度很低，目前的 LC-NMR只能作H NMR，一般通過檢測與C相連的H來檢測C，這樣一部分重要的化合物結(jié)構(gòu)信息會由此缺損。另外，采用溶劑信號抑制技術(shù)雖可抑制溶劑信號，但若待測化合物的信號恰好與溶劑峰重疊，則將導(dǎo)致部分結(jié)構(gòu)信息丟失;并且在此條件下測得的化合物的化學(xué)位移與在標(biāo)準(zhǔn)氘代試劑下測定的化學(xué)位移有一定的偏差。

盡管LC-NMR目前仍有較大問題需要克服，但它是中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展的前沿方向，現(xiàn)已出現(xiàn)商品化 LC-NMR和 LCNMR-MS儀器。采用 LC-NMR和 LC-NMRMS對中草藥化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定已見報道。為解決LC-NMR靈敏度低的缺點，可采用在線固相萃取(SPE)裝置使待測成分得到濃集，多次進(jìn)樣后能獲得足夠的樣品量。Clarkson等人使用 HPLC-SPE-NMR研究了植物Kanahia laniflora中的黃酮類和強(qiáng)心苷類成分。

1.4 擴(kuò)散排序核磁共振技術(shù)(DOSY) 該技術(shù)是利用混合物溶液中不同化學(xué)成分一般具有不同擴(kuò)散系數(shù)的物理特性，用核磁共振脈沖梯度場法不分離分析混合物中化學(xué)成分結(jié)構(gòu)。該技術(shù)省時省力，尤其適用于定性分析在分離過程中易發(fā)生變化的化學(xué)成分。

2 中藥質(zhì)量分析研究領(lǐng)域

2.1 中藥有效成分分析技術(shù)檢測 中藥有效成分常使用GC、LC、毛細(xì)管電泳(CE)等色譜分離法，配以紫外(UV)、蒸發(fā)光散射(ELSD)、質(zhì)譜、脈沖安培(PAD)、熒光(FLD)、氮化學(xué)發(fā)光(CLND)或電霧式(CAD)等不同的檢測器，其中UV、ELSD及MS檢測器應(yīng)用較多;MS、PAD、FLD和CLND為高靈敏度檢測器，而MS、ELSD和CAD為通用型檢測器，特別適用于檢測無紫外吸收或紫外吸收較弱的化合物。美國ESA公司于2003年推出的CAD檢測器，靈敏度是ELSD的10倍左右，且線性范圍寬，在中藥分析中有很好的應(yīng)用前景。

定量核磁共振(qNMR)具有無需對照品，樣品預(yù)處理簡單，定量準(zhǔn)確等特點。在某些中藥成分的測定中有著獨特優(yōu)勢。

2.2 中藥指紋圖譜分析技術(shù) 化學(xué)指紋圖譜能表征中藥復(fù)雜成分的整體特征，已被 WHO、美國FDA和我國SFDA等藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)采納并用于植物藥或中藥質(zhì)量檢驗，許多研究者將其用于中藥質(zhì)量控制。目前，化學(xué)指紋圖譜研究以HPLC為主，GC和CE等其它指紋圖譜研究報道較少。當(dāng)中藥化學(xué)物質(zhì)組成十分復(fù)雜，含有多類理化性質(zhì)差異較大的成分時，使用單一化學(xué)指紋圖譜難以涵蓋中藥物質(zhì)體系的整體化學(xué)信息。LC、GC和CE所檢測的化學(xué)成分不同，分析信息可互補(bǔ)。為全面表征中藥化學(xué)組成，多源指紋圖譜分析技術(shù)成為發(fā)展方向。多源色譜指紋圖譜一般采用不同的檢測器同時檢測有紫外吸收和無紫外吸收成分，如LC-UVELSD、LC-UV-MS等。LC指紋圖譜與多指標(biāo)成分含量測定相結(jié)合的定量指紋圖譜能更準(zhǔn)確的表達(dá)中藥整體信息。此外，中藥譜效關(guān)系研究為制定基于藥效的中藥產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了新思路。

2.3 中藥有毒有害成分分析技術(shù) 中藥在種植、貯存和制造等過程中會受到農(nóng)藥、重金屬和真菌毒素等有毒有害物質(zhì)污染，因此急需建立快速、靈敏、專屬的檢測方法來監(jiān)管。檢測中藥中有害殘留物屬痕量或超痕量分析，對儀器分析技術(shù)要求很高。目前主要采用 GC-MS或LC-MS檢測中藥有毒有害成分，毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)檢測法也有少量報道。由于中藥基質(zhì)復(fù)雜，樣品預(yù)處理是檢測有害殘留物的關(guān)鍵步驟之一，研究適合于不同類型中藥基質(zhì)的樣品預(yù)處理方法十分重要。在2010版《中國藥典》中，真菌毒素的檢測方法為 LCFLD，但已有越來越多的報道使用 LC-MS。LC-MS專屬性高、假陽性率低，今后可能會取代LC-FLD法。檢測重金屬的常用方法包括分光光度法、原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法、熒光分析法等，但大多只能單個元素測定。新的電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)可同時測定多個成分，且檢出限更低。

隨著龍膽瀉肝丸、關(guān)木通等個別中藥藥害事件的發(fā)生，中藥安全性越來越受到公眾關(guān)注，中藥毒性成分檢測已成為中藥質(zhì)量控制技術(shù)研究的重要方面。

3 中藥藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制研究領(lǐng)域

3.1 中藥藥效物質(zhì)篩選技術(shù) 生物色譜法出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代中后期，它將藥效成分的分離與篩選相結(jié)合，克服了中藥分離分析的盲目性。親和超濾是近年來發(fā)展的一種篩選技術(shù)，具有親和層析的高選擇性和超濾處理樣本快速等優(yōu)點，Choi等將超濾篩選與 LC-MS檢測結(jié)合，可快速篩選出作用于QR-2的活性物質(zhì)。Yasuda將SIRT6酶結(jié)合在磁珠上，用于從葫蘆巴提取物中篩選治療低血糖及衰老相關(guān)疾病的活性物質(zhì)。

3.2 中藥作用機(jī)制的組學(xué)分析技術(shù) 中藥的組學(xué)研究包括基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等。基因芯片是最主流的組學(xué)分析技術(shù)，常用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析有二維電泳(2-DE)、熒光差異二維電泳技術(shù)(DIGE)、蛋白質(zhì)芯片和LC-MS 技術(shù)等，代謝組學(xué)分析包括 NMR、GC-MS、LC-MS 以及 CE-MS 等技術(shù)。UPLCQ-TOF-MS因其性能優(yōu)越，得到了研究者的青睞。

4 中藥體內(nèi)過程及藥代動力學(xué)研究領(lǐng)域

中藥體內(nèi)過程分析及藥代動力學(xué)研究對于闡明中藥作用機(jī)制及指導(dǎo)中藥臨床合理用藥有十分重要的意義。由于中藥藥效成分往往含量很低，體內(nèi)濃度甚微，基質(zhì)復(fù)雜，導(dǎo)致中藥體內(nèi)分析難度很大，要求分析方法具有較高的靈敏度及選擇性。LC-MS/MS可通過選擇反應(yīng)檢測(SRM)或多反應(yīng)檢測(MRM)等模式消除背景干擾，提高靈敏度，是中藥體內(nèi)分析的最主要技術(shù)。

5 中藥制藥過程質(zhì)量控制研究領(lǐng)域

過程分析技術(shù)(PAT)由美國政府FDA倡導(dǎo)。該技術(shù)是通過對整個制藥過程進(jìn)行分析，深刻了解制藥過程原理，實施制藥過程質(zhì)量控制，建立科學(xué)嚴(yán)格的藥品質(zhì)量保障體系。近紅外光譜是醫(yī)藥工業(yè)最為常用的在線檢測設(shè)備，也是PAT在中藥制藥產(chǎn)業(yè)應(yīng)用研究的熱點。近紅外光譜已用于鑒別藥材來源、測定中藥的主要成分含量，以及在線檢測中藥生產(chǎn)過程的質(zhì)量指標(biāo)等。

6 總結(jié)與展望

以{主題 =(“chinese medicine”or(herb*not herbicide)or botanical)AND出版類型=(Article)}進(jìn)行搜索，近5年關(guān)于中藥或植物藥研究的SCI收錄文獻(xiàn)量為34 240篇，年平均增幅約為500篇，表明中藥及天然藥物已吸引越來越多的研究者;對論文作者所在國的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，美國、中國和德國是該領(lǐng)域發(fā)表論文數(shù)量的前三強(qiáng)，美國最多，中國緊隨其后。中藥分析方面的大部分論文采用HPLC方法，而LC-MS已成為主流技術(shù);CE雖在分離效率和分析速度上有諸多優(yōu)勢，但在中藥分析中應(yīng)用仍較少;UPLC/RRLC作為一種新技術(shù)尚未推廣普及。

在未來若干年，聚焦于中藥質(zhì)量檢驗、中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、現(xiàn)代中藥創(chuàng)制等重點應(yīng)用領(lǐng)域，中藥分析技術(shù)將得到創(chuàng)新發(fā)展，其主要趨勢為:在中藥質(zhì)量檢驗方面，LC-復(fù)合型質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將得到更多應(yīng)用，多源化學(xué)指紋圖譜研究將取得新突破;中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面涌現(xiàn)出一些新的篩選-分析集成技術(shù)，高分辨核磁共振技術(shù)得到有效應(yīng)用;組學(xué)分析技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及多元藥理學(xué)相結(jié)合，可望揭示中藥多組分多靶點整合調(diào)節(jié)機(jī)制，并為創(chuàng)制基于網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的多靶點新藥提供技術(shù)手段。

［1］CHENG X，WAN J，LI P，et al.Ultrasonic/microwave assisted extraction and diagnostic ion filtering strategy by liquid chromatographyquadrupole time-of-flight mass spectrometry for rapid characterization of flavonoids in Spatholobus suberectus［J］.Journal of Chromatography A，2011，1218(34):5774-5786.

［2］SHEN Y，HAN C，JIANG Y，et al.Rapid quantification of four major bioactive alkaloids in Corydalis decumbens (Thunb.) Pers. by pressurised liquid extraction combined with liquid chromatography-triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry ［J］.Talanta，2011，84(4):1026-1031.

［3］CAO G，ZHANG C，ZHANG Y，et al.Global detection and identification of components from crude and processed traditional Chinese medicine by liquid chromatography connected with hybrid ion trap and time-of-flight-mass spectrometry ［J］.Journal of Separation Science，2011，34(15):1845-1852.

［4］PENG J B，JIA H M，LIU Y T，et al.Qualitative and quantitative characterization of chemical constituents in Xin-Ke-Shu preparations by liquid chromatography coupled with a LTQ Orbitrap mass spectrometer［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，55(5):984-995.

［5］WU Y，WANG Y，GU X，et al.Two-dimensional strong cation-exchange liquid chromatography/reversed-phase pressurized capillary electrochromatography for separation of complex samples［J］.Journal of Separation Science，2011，34(9):1027-1034.

［6］DIAS D A，URBAN S.Phytochemical studies of the southern Australian marine alga，Laurencia elata［J］.Phytochemistry，2011，72(16):2081-2089.

［7］KANG S W，Kim C Y，SONG D G，et al.Rapid identification of furanocoumarins in Angelica dahurica using the online LC-MMR-MS and their nitric oxide inhibitory activity in RAW 264.7 cells［J］.Phytochemical Analysis，2010，21(4):322-327.

［8］CLARKSON C，STAERK D，HANSEN S H，et al.Hyphenation of solid-phase extraction with liquid chromatography and nuclear magnetic resonance:application of HPLC-DAD-SPE-NMR to identification of constituents of Kanahia laniflora［J］.Analytical Chemistry，2005，77(11):3547-3553.

［9］VAYSSE J，BALAYSSAC S，GILARD V，et al.Analysis of adulterated herbal medicines and dietary supplements marketed for weight loss by DOSYHNMR ［J］.Food Additives and Contaminants:Part A，2010，27(7):903-916.

［10］SUN J，GUO H，SEMIN D，et al.Direct separation and detection of biogenic amines by ion-pair liquid chromatography with chemiluminescent nitrogen detector［J］.Journal of Chromatography A，2011，1218(29):4689-4697.

［11］BAI C C，HAN S Y，CHAI X Y，et al.Sensitive determination of saponins in radix et rhizoma notoginseng by charged aerosol detector coupled with HPLC ［J］. Journal of Liquid Chromatography ＆ Related Technologies，2009，32(2):242-260.

［12］LIU N Q，CHOI Y H，VERPOORTE R，et al.Comparative quantitative analysis of artemisinin by chromatography and qNMR ［J］.Phytochemical Analysis，2010，21(5):451-456.

［13］YANG D，AN T Q，JIANG X，et al.Development of a novel method combining HPLC fingerprint and multi-ingredients quantitative analysis for quality evaluation of traditional chinese medicine preparation ［J］.Talanta，2011，85(2):885-890.

［14］BOYLE S P，DOOLAN P J，ANDREWS C E，et al.Evaluation of quality control strategies in Scutellaria herbal medicines［J］.Journal of Pharmaceutical And Biomedical Analysis，2011，54(5):951-957.

［15］LI X，WANG L，WANG Z，et al.Ultrasonic nebulization extraction coupled with headspace hollow fiber microextraction of pesticides from root of Panax ginseng C.A.Mey ［J］.Journal of Separation Science，2011，34(13):1582-1589.

［16］HAN Z，ZHENG Y，LUAN L，et al.An ultra-highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of aflatoxins B1，B2，G1，G2，M1 and M2 in traditional Chinese medicines ［J］.Analytica Chimica Acta，2010，664(2):165-171.

［17］KOU X M，XU M，GU Y Z.Determination of trace heavy metal elements in cortex phellodendri chinensis by ICP-MS after microwave-assisted digestion ［J］.Spectroscopy and Spectral Analysis，2007，27(6):1197-1200.

［18］HEATON J，WHILEY L，HONG Y，et al.Evaluation of Chinese medicinal herbs fingerprinting by HPLC-DAD for the detection of toxic aristolochic acids ［J］.Journal of Separation Science，2011，34(10):1111-1115.

［19］CHOI Y，JERMIHOV K，NAM S，et al.Screening natural products for inhibitors of quinone reductase-2 using ultrafiltration LC-MS ［J］.Analytical Chemistry，2011，83(3):1048-1052.

［20］YASUDA M，WILSON D R，F(xiàn)UGMANN S D，et al.Synthesis and characterization of SIRT6 protein coated magnetic beads:identification of a novel inhibitor of SIRT6 deacetylase from medicinal plant extracts［J］.Analytical Chemistry，2011，83(19):7400-7407.

［21］WEN Z，WANG Z，WANG S，et al.Discovery of molecular mechanisms of traditional Chinese medicinal formula Si-Wu-Tang using gene expression microarray and connectivity map［J］.PLoS ONE，2011，6(3):e18278.

［22］ZHOU Y，LU L，LI Z，et al.Antidepressant-like effects of the fractions of Xiaoyaosan on rat model of chronic unpredictable mild stress［J］.Journal of Ethnopharmacology，2011，137(1):236-244.

［23］LI X，LUO X，LU X，et al.Metabolomics study of diabetic retinopathy using gas chromatographymass spectrometry:a comparison of stages and subtypes diagnosed by Western and Chinesemedicine ［J］.Molecular Biosystems，2011，7(7):2228-2237.

［24］LIU S，LU F，WANG X，et al.Metabolomic study of a rat fever model induced with 2，4-dinitrophenol and the therapeutic effects of a crude drug derived from coptis chinensis［J］.American Journal of Chinese Medicine，2011，39(1):95-109.

［25］XIA Y，WEI G，SI D，et al.Quantitation of ursolic acid in human plasma by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry and its pharmacokinetic study ［J］. Journal of Chromatography B，2011，879(2):219-224.

［26］ZHENG X，XU L，LIANG Y，et al.Quantitative determination and pharmacokinetic study of solamargine in rat plasma by liquid chromatography-mass spectrometry［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，55(5):1157-1162.

［27］LAI Y，NI Y，KOKOT S.Discrimination of Rhizoma Corydalis from two sources by nearinfrared spectroscopy supported by the wavelet transform and least-squares support vector machine methods［J］.Vibrational Spectroscopy，2011，56(2):154-160.

［28］LAU C C，CHAN C O，CHAU F T，et al.Rapid analysis of Radix puerariae by near-infrared spectroscopy［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216(11):2130-2135.

［29］HUANG H，QU H.In-line monitoring of alcohol precipitation by near-infrared spectroscopy in conjunction with multivariate batch modeling［J］.Analytica Chimica Acta，2011，707(1-2):47-56.