周 甄 徐漢江 張海洋 王倚天 黃大可 朱華慶 汪 淵 賈雪梅△

1（安徽醫(yī)科大學(xué) 第一臨床學(xué)院，合肥230032）

2（安徽醫(yī)科大學(xué) 形態(tài)學(xué)中心實驗室，合肥230032）

3（安徽醫(yī)科大學(xué) 生化教研室，合肥230032）

高脂血癥（hyperlipidemia）是指血漿總膽固醇（TC）和（或）甘油三酯（TG）的異常增高。特別是低密度脂蛋白（LDL）和膽固醇（TG）對血管內(nèi)膜損傷，可導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生（AS）［1］。大量流行病學(xué)調(diào)查證明［2］，大多數(shù)AS患者血中膽固醇水平比正常人高，而AS的嚴(yán)重程度隨血漿膽固醇水平的升高而加重，隨著現(xiàn)代經(jīng)濟生活水平的提高，AS的發(fā)病率和死亡率逐年升高，成為危害人類健康的嚴(yán)重因素。熱休克蛋白（HSP）是細(xì)胞在受到熱應(yīng)激或其他應(yīng)激源的刺激時能夠高效表達(dá)的一類蛋白。近年來一些實驗表明，高脂血癥可成為腎病發(fā)生的病理機制之一［3］，而高脂血癥和動脈粥樣硬化的發(fā)生與熱休克蛋白所引發(fā)的免疫應(yīng)答之間有重要關(guān)聯(lián)［4］。故本實驗采用高脂飲食喂食大鼠模型，通過HE染色和免疫組化染色觀察大鼠腎組織病理學(xué)改變和HSP70的表達(dá)。探究大鼠高脂血癥模型腎組織損傷與HSP70表達(dá)水平的相關(guān)性并探討HSP70表達(dá)在組織細(xì)胞中的作用和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Nikon顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)；德國萊卡切片機；Ⅰ抗為鼠IgG 抗HSP70抗體（購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Ⅱ抗山羊抗兔通用二抗，辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液及DAB 試劑（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 動物模型的建立與分組

健康大鼠按體重編號，隨機分為正常組和高脂血癥組兩組，每組各5只。正常組：室溫及穩(wěn)定適度條件下，全價顆粒飼料喂養(yǎng)。高脂血癥組：高脂飼料成分：基礎(chǔ)飼料含膽固醇1%，豬油5%。動物分只單獨飼養(yǎng)，自由飲食與飲水。

1.3 標(biāo)本的制備

實驗第12周處死大鼠，眼眶取血檢測各組鼠血脂水平，取出腎臟，用生理鹽水沖洗然后吸干水分，l0%甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚4μm。

1.4 HE染色

切片脫蠟至水，入蘇木精染色20 min，再進(jìn)行分色、藍(lán)化，入伊紅染色2 min，脫水、透明和封片，觀察結(jié)果。

1.5 免疫組化染色

切片脫蠟至水，將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐抗原熱修復(fù)后，加入去離子水H2O2（滅活內(nèi)源性酶），再加入正常山羊血清封閉液。滴加1∶100比例稀釋的一抗HSP70，4℃過夜后滴加二抗，后加入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，DAB 顯色后，蘇木精輕度復(fù)染，中性樹脂封片并觀察。陰性對照實驗滴加PBS代替一抗，其余步驟做相同處理。

1.6 計算機圖像分析與統(tǒng)計處理

應(yīng)用計算機圖像分析系統(tǒng)，將免疫組化染色的切片在光鏡下統(tǒng)一放大10×40倍，每張切片上隨機選取5個視野進(jìn)行細(xì)胞著色的統(tǒng)計學(xué)分析，計算機測量陽性細(xì)胞的HSP70表達(dá)含量（以相對光密度值表示）。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 血脂檢測結(jié)果

取保存于－80℃的血清，檢測各組TG，TC，HDL－C水平，其中檢測工作由解放軍105醫(yī)院檢驗科完成。高脂血癥組TG，TC，HDL－C 水平與正常組比較有顯著增高（見表1）。

表1 大鼠血脂水平檢測結(jié)果比較（，mmol／L）Table 1 Compare of the level of blood－fat in rats（，mmol／L）

表1 大鼠血脂水平檢測結(jié)果比較（，mmol／L）Table 1 Compare of the level of blood－fat in rats（，mmol／L）

注：與正常組比較，＊P＜0.05

2.2 HE染色結(jié)果

正常組：腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細(xì)胞未見變性、腫脹。細(xì)胞排列整齊、完整。高脂血癥組可見部分腎小管上皮細(xì)胞破碎，核固縮，胞漿輕微腫脹變性，細(xì)胞排列紊亂。腎小囊周圍有少量炎性細(xì)胞浸潤，腎小囊內(nèi)細(xì)胞有空泡形成（見圖1）。

2.3 免疫組化染色結(jié)果

正常組大鼠腎臟免疫組化結(jié)果為弱陽性，HSP70在腎小球中幾乎無陽性細(xì)胞表達(dá)，腎小管有微量至中等陽性表達(dá)。高脂血癥組大鼠腎小球中HSP70 有少量陽性細(xì)胞表達(dá)，腎小管上皮中有HSP70表達(dá)，為強陽性反應(yīng)（見圖2）。

2.4 計算機圖像分析結(jié)果

正常組的HSP70 平均光密度值為0.1185±0.0078，高脂血癥組平均光密度值為0.3106±0.0484。高脂血癥組與正常組相比較，HSP70表達(dá)含量顯著增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。

表2 大鼠腎組織內(nèi)HSP70平均光密度值比較（）Table 2 Compare of the value of average optical density of HSP70of kedney in rats（，mmol／L）

表2 大鼠腎組織內(nèi)HSP70平均光密度值比較（）Table 2 Compare of the value of average optical density of HSP70of kedney in rats（，mmol／L）

注：與正常組比較，＊P＜0.05

3 討論

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是指一組廣泛存在于生物進(jìn)化過程中高度保守的多肽蛋白，它在應(yīng)激原特別是環(huán)境高溫誘導(dǎo)下能夠高效生成表達(dá)。全氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)該類蛋白具有80%以上的相似性。這種蛋白最初由Ritossa在研究果蠅的唾液腺多絲染色體中所發(fā)現(xiàn)并由后人于果蠅幼蟲的唾液腺中分離［5］。除高溫條件外，多種應(yīng)激如缺血、缺氧、感染、重金屬等都可誘導(dǎo)HSP的大量表達(dá)［6］。研究表明，HSP70在保護(hù)細(xì)胞時，其誘導(dǎo)的數(shù)量與保護(hù)作用的強弱呈正相關(guān)［7］。由此可見，熱休克蛋白作為一種重要的保護(hù)蛋白，對維持機體的穩(wěn)定性和環(huán)境適應(yīng)性具有重要的生理意義。熱休克蛋白不僅具有應(yīng)激性，大部分的熱休克蛋白還能以分子伴侶的形式參加機體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、折疊、修飾加工、運載和降解。Morimoto等［8］將主要的HSP分為HSP90、HSP70、HSP60及小HSP 等4個家族。其中，HSP70對應(yīng)激條件最敏感，是具有重要應(yīng)激保護(hù)作用的分子。近年來，科學(xué)界對HSP70的研究頗多且較深入，如有關(guān)腎間質(zhì)細(xì)胞高滲透壓引起的腎髓質(zhì)HSP70的表達(dá)增高［9］，高脂引起的大鼠血漿內(nèi)HSP70表達(dá)的研究［2］，以及熱應(yīng)激大白鼠脾臟和肝臟組織HSP70表達(dá)的研究［10］等。由于HSP70的應(yīng)激效果明顯，故大部分實驗著重于其應(yīng)激反應(yīng)的研究。

本實驗中高脂血癥組的TG，TC，HDL－C 含量均明顯高于正常組，提示造模成功；形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，高脂血癥組部分腎小管上皮細(xì)胞破碎，核固縮，胞漿輕微腫脹變性，細(xì)胞排列紊亂。腎小囊部分破壞，球內(nèi)細(xì)胞部分壞死消失空泡化。與正常組對比顯示，該模型組有較為嚴(yán)重的病理改變。而免疫組化結(jié)果顯示：高脂血癥組腎組織中HSP70的表達(dá)為強陽性，比正常組顯著增多。研究發(fā)現(xiàn)：由高脂飲食引發(fā)的高脂血癥使腎臟組織受損，其組織細(xì)胞腫脹變性，并出現(xiàn)不同程度的病變，其受損模型高表達(dá)HSP70，由此可見，HSP70的表達(dá)可作為機體組織損傷的抗應(yīng)激保護(hù)機制，組織細(xì)胞受損能夠引起HSP70的高效表達(dá)。高表達(dá)的HSP70提示腎臟受到損害并引起炎癥反應(yīng)誘發(fā)應(yīng)激保護(hù)機制。王麗娜等［11，12］曾報道HSP70在肝癌組織細(xì)胞中呈強陽性表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增生與凋亡，與肝癌的發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)行為以及預(yù)后都有著密切的關(guān)系。周成福等［5］也報道在大鼠急性脊髓損傷模型HSP70呈高表達(dá)。此外，童雨田等［13］有關(guān)于HSP70在兔動脈粥樣硬化易損斑塊內(nèi)的高表達(dá)則進(jìn)一步揭示了其過度表達(dá)時能夠引起炎性反應(yīng)。綜上所述，HSP70在高脂血癥腎臟組織損傷模型中可能的調(diào)控機制及生理意義為：①作為各種生物所共有的起應(yīng)急保護(hù)的高度保守蛋白，HSP70在高脂血癥腎損傷模型腎小管中高表達(dá)，而在腎小球中僅有微量表達(dá)，可以推斷出高脂血癥引起的腎損傷主要發(fā)生在腎小管。②高脂血癥引起的腎臟組織損傷激活了HSP70的應(yīng)急保護(hù)機制，使得HSP70 在腎臟組織細(xì)胞中高表達(dá)，通過HSP70 的表達(dá)程度來預(yù)測腎臟的損傷程度，使得熱休克蛋白不僅成為衡量組織損傷程度的一個重要指標(biāo)，腎臟中HSP70水平的顯著提高也預(yù)示著高血脂癥已經(jīng)對腎臟產(chǎn)生了威脅，從而成為腎臟早期衰竭的預(yù)警標(biāo)志物。③在腎組織修復(fù)損傷細(xì)胞的進(jìn)程中，HSP70可作為炎癥因子及抗原，介導(dǎo)多種應(yīng)激刺激信號如IL－6和免疫細(xì)胞，以巨噬細(xì)胞為主，誘發(fā)炎性反應(yīng)與免疫反應(yīng)［13］。HSP70 已成為有效的抗細(xì)胞凋亡機制的中介［14］，因而HSP70高表達(dá)成為受損組織保護(hù)修復(fù)機制中不可或缺的重要環(huán)節(jié)之一。其具體機制尚待研究。因此HSP70的高表達(dá)為研究機體組織損傷程度和定位，以及的治療方法提供了新思路，對臨床上疾病的早期預(yù)防與治療具有重要意義。

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