郭開峰 曾 云

1（自貢市第四人民醫(yī)院 腫瘤科，自貢643000）

2（川北醫(yī)學院 藥理教研室，南充637007）

腫瘤研究者認為腫瘤內(nèi)部含有一小部分具有自我更新、多向分化潛能的細胞，即腫瘤干細胞［1－3］。這小部分細胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)、轉移、耐藥及放療抵抗的根源［2－4］。因此，分離并對其生物學特性進行研究對腫瘤的診斷、治療具有重要意義。本實驗選取結腸癌細胞株CW－2為研究對象，應用無血清懸浮培養(yǎng)法初步獲得腫瘤干細胞，并對其進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌細胞株CW－2購自中國科學院上海生命科學院細胞庫；RPMI1640 和DMEM／F12 培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胰酶購自Gibco公司；重組人表皮細胞生長因子（Recombinant Human Epidermal Growth Factor，EGF）、重組人白血病抑制因子（Recombinant Human Leukemia Inhibitory factor，LIF）、重組人堿性成纖維生長因子（Recombinant Human fibroblast growth factor－basic，bFGF）購自Sinobio公司；青霉素G、鏈霉素購自華北制藥股份有限公司；Anti－CD44－FITC、Anti－EpCAM－PerCP－Cy5.5和其同型抗體購自BD Bioscience公司。

2 方法

2.1 CW－2細胞在含血清培養(yǎng)基（SSM）中常規(guī)培養(yǎng)

將CW－2細胞以105個／ml接種于含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基中。在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換液。待細胞長滿瓶底約80%時傳代。

2.2 無血清懸浮培養(yǎng)富集CW－2干細胞

2.2.1 將在SSM 中處于對數(shù)增長期的細胞以105個／ml接種于無血清懸浮培養(yǎng)液（serum－free medium，SFM）中傳代培養(yǎng)。前14d直接向培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液，14d后通過胰酶消化法和機械吹打法分離成單細胞懸液后傳代。每天觀察CW－2 細胞在SFM 中形成腫瘤干細胞球的過程。

2.2.2 向長滿瓶底80%的SSM 培養(yǎng)細胞直接換液為SFM，在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換液，觀察其生長情況。

2.3 流式細胞檢測CD44、EPCAM 的表達

將含血清常規(guī)培養(yǎng)、無血清懸浮培養(yǎng)細胞球分別以106個／ml重懸于200μl PBS中，分別加入20 μl的Anti－CD 44－FITC和Anti－EPCAM－PerCP－Cy 5.5。對照組加入同型鼠IgG，避光孵育30 min，1000r／min離心5 min，棄上清，PBS洗2 次，離心棄上清，用200μl PBS 重懸細胞，上機分析。檢測CD 44＋EPCAM＋細胞比例。

2.4 細胞分化實驗

無血清懸浮培養(yǎng)14d，形成干細胞球后，向培養(yǎng)液中加入胎牛血清，觀察腫瘤干細胞球的生長情況。

2.5 細胞周期檢測

收集無血清懸浮培養(yǎng)前后的細胞懸液，1000r／min離心5min，棄上清，75%乙醇固定后加solution A 250μl，用手輕擊試管將細胞混勻，室溫下10min；加solution B 200μl，室溫下10min；加solution C 200 μl，混勻，2～8℃10min，上流式細胞儀檢測。

2.6 動物致瘤實驗

8只4－5周齡NOD／SCID 三聯(lián)免疫缺陷小鼠由四川大學實驗動物中心提供，雌雄各半。完全隨機分組法分別分成含血清培養(yǎng)組和無血清懸浮培養(yǎng)組，將含血清培養(yǎng)細胞和無血清懸浮培養(yǎng)細胞收集后調(diào)整至所需濃度，按1∶1比例與Matrigel混合，分別以104個細胞數(shù)量于右肩胛部皮下接種。每周2次觀察腫瘤生長狀況，4w 后將小鼠斷頸處死，照相后摘取皮下腫瘤。

3 結果

3.1 SFM 培養(yǎng)形成懸浮的腫瘤干細胞球

CW－2細胞接種于SFM 中，第2d大部分細胞貼壁，幾乎無死亡細胞（見圖1A），第7d時大部分細胞壞死、凋亡崩解，僅有少部分細胞存活下來并形成疏松的懸浮腫瘤干細胞球（見圖1B）。新形成的腫瘤干細胞球不規(guī)則，新生單個細胞以“出芽”的方式連接在球體上。第14d時細胞球明顯較第7d時更大、連接更緊密、不易準確區(qū)分細胞與細胞間界限（見圖1C）。

3.2 流式細胞學檢測

流式細胞儀檢測培養(yǎng)收集的無血清懸浮培養(yǎng)前后細胞懸液中干細胞含量。結果顯示無血清懸浮培養(yǎng)前后細胞中CD44＋EpCAM＋細胞含量分別為0.36%及60.39%（見圖2）。

3.3 細胞分化實驗

無血清懸浮培養(yǎng)14天，形成較大細胞球，向培養(yǎng)基中加入胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)第2天，懸浮的細胞球就出現(xiàn)貼壁生長（見圖3）。

3.4 體內(nèi)成瘤實驗

分別以104個細胞注入NOD－SCID 小鼠右肩胛皮下接種。腫瘤干細胞球組第9d可捫及腫瘤，后逐漸增大（見圖4），而SSM 組始終無腫瘤生長。摘取皮下腫瘤，計算成瘤體積，兩者之間的差距有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 無血清懸浮培養(yǎng)富集CD44＋EPCAM＋干細胞Fig.1 Suspended CD44＋EPCAM＋cancer stem cell spheres formed in SFM

圖2 流式細胞學檢測無血清懸浮培養(yǎng)前后細胞中CD44＋EPCAM＋細胞Fig.2 CD4＋EPCAM＋cancer stem cells were identified by Fluorescence－activated cell sorting

4 討論

近年來國內(nèi)外研究表明結腸癌中含一小部分具有自我更新、多向分化潛能的結腸癌干細胞，分離出這一小部分細胞是結腸癌干細胞的實驗室研究及結腸癌的臨床治療的關鍵［4－6］。

無血清條件能夠誘導非癌干細胞凋亡壞死，而癌干細胞卻能夠適應該環(huán)境而長期的穩(wěn)定存活，并形成懸浮的細胞球，根據(jù)癌干細胞的這種生長特點，本實驗以結腸癌細胞株CW－2 為研究對象，參照Dalerba等［1］的方法，將CD44和EPCAM 作為結腸癌干細胞的表面標志物，運用流式細胞技術分離出具有干細胞特性的CD 44＋EPCAM＋細胞群，檢測無血清懸浮培養(yǎng)細胞初步富集結腸癌干細胞中結腸癌干細胞的含量。鑒于結腸癌干細胞具有高分化、高致瘤性，是結腸癌的復發(fā)、侵襲、轉移的根源［5，6］，故本實驗進一步采用細胞分化實驗、體內(nèi)成瘤實驗對其進行鑒定。結果表明無血清懸浮培養(yǎng)可以獲得CD44＋EPCAM＋細胞含量為60.39%，顯著高于富集前的0.36%，該群細胞具有干細胞特性［7，8］。

綜上所述，無血清懸浮培養(yǎng)是簡單而有效的初步富集結腸癌干細胞的方法，為結腸癌干細胞的生物學性能研究奠定的理論與實踐基礎。

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