上海醫(yī)藥工業(yè)研究院（200040）史卓維

上海市食品藥品檢驗(yàn)所(201203）史芳亮 陳鋼Δ

糜蛋白酶（Chymotrypsin），又稱胰凝乳蛋白酶，系從牛或豬胰腺中提取的一種蛋白水解酶，具有肽鏈內(nèi)切酶的作用，臨床上主要用于眼科手術(shù)，也可用于創(chuàng)口或局部炎癥，以減少局部分泌和水腫[1]。注射用糜蛋白酶為無(wú)菌凍干粉末，輔料為20%甘露醇和右旋糖酐20，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為2010版中國(guó)藥典。

比活是單位蛋白質(zhì)重量下的酶活力，它是在理化方法無(wú)法控制酶的純度或有關(guān)物質(zhì)時(shí)可采用的最有效的控制酶純度的方法之一。由于注射用糜蛋白酶現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有效價(jià)測(cè)定，而沒(méi)有比活或者純度檢查項(xiàng)，因此無(wú)法對(duì)企業(yè)低效價(jià)原料多投料的情況進(jìn)行監(jiān)控，從而可能對(duì)患者的用藥安全性造成潛在危害。目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未有注射用糜蛋白酶比活測(cè)定與純度測(cè)定方法的報(bào)道。本文旨在分別建立一種適用于注射用糜蛋白酶比活測(cè)定的方法以及RP-HPLC純度測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），Spectra max 340pc酶標(biāo)儀（美國(guó)分子儀器公司），F(xiàn)oss Kjeltec 2400自動(dòng)凱氏定氮儀（瑞典FOSS公司），UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司），瑞士Mettler Toledo AB204-S電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），Grace 214TP C4色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，美國(guó)格雷斯公司）。

附表1 凱氏定氮法加樣回收率測(cè)定結(jié)果

附表4 注射用糜蛋白酶RP-HPLC純度測(cè)定結(jié)果

考馬斯亮藍(lán)試劑盒（貨號(hào)23200，美國(guó)Thermo公司），BCA試劑盒（貨號(hào)QPBCA，美國(guó)Sigma公司），牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA，批號(hào)14619-200919，中國(guó)藥品生物制品檢定所），USP糜蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品（貨號(hào)1134007，美國(guó)藥典會(huì)），硫酸銅、酒石酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鈉、硫酸銨均為分析純，乙腈、三氟乙酸為色譜純，水為去離子水。

注射用糜蛋白酶共5個(gè)批號(hào)，規(guī)格均為4000單位/瓶，批號(hào)為20090709、20110315、20110316和批號(hào)為0905031、1101021的制劑來(lái)自兩家國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)。

2 比活測(cè)定方法

比活是單位蛋白質(zhì)重量下的酶活力，因此要分別測(cè)定每瓶制劑中的總蛋白量以及酶活力（即效價(jià)）。

2.1 凱氏定氮法 取各批號(hào)樣品5瓶，用適量水完全轉(zhuǎn)移至定氮管中，120℃濃縮至5ml左右后，參照中國(guó)藥典2010版二部附錄Ⅶ M蛋白質(zhì)測(cè)定法中的凱氏定氮法測(cè)定總氮，按照中國(guó)藥典2010版三部附錄Ⅵ B中三氯乙酸法測(cè)定非蛋白氮。根據(jù)公式：蛋白氮=總氮-非蛋白氮、真蛋白=蛋白氮×氮轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)的系數(shù)6.25[2]計(jì)算得到每瓶制劑中所含的總蛋白量。

2.2 考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）、2,2’-聯(lián)喹啉-4,4’-二羧酸法（BCA法） 將各批號(hào)樣品用水稀釋至蛋白質(zhì)濃度為250μg/ml和10μg/ml左右，然后分別參照Bradford和BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

2.3 福林酚法 將樣品用水稀釋至蛋白質(zhì)濃度為100μg/ml左右，參照中國(guó)藥典2010版二部附錄Ⅶ M蛋白質(zhì)測(cè)定法中的福林酚法進(jìn)行操作。

2.4 比活計(jì)算 按照2010版中國(guó)藥典二部中注射用糜蛋白酶效價(jià)測(cè)定項(xiàng)下的方法對(duì)5批制劑進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，再結(jié)合所測(cè)得的總蛋白量計(jì)算比活，公式：比活（單位/mg）=效價(jià)（單位/瓶）/蛋白質(zhì)含量（mg/瓶）。

3 純度測(cè)定方法

3.1 溶液的制備

3.1.1 對(duì)照品溶液 取USP糜蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品，加0.1%三氟乙酸水溶液溶解并稀釋制成1mg/ml的溶液。

3.1.2 供試品溶液 取樣品，加0.1%三氟乙酸水溶液溶解并稀釋制成每1ml中約含1000單位的溶液。

3.1.3 空白輔料溶液 按2家生產(chǎn)企業(yè)的處方稱取輔料，用0.1%三氟乙酸水溶液溶解并稀釋制成不含糜蛋白酶的空白輔料溶液。

3.2 色譜條件 色譜柱采用Grace 214TP C4色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為0.09%三氟乙酸水溶液（A）和0.1%三氟乙酸乙腈（B），梯度洗脫[0～5min，A：B維持95：5不變；5～30min，A：B比例從95：5下降至40：60；30～40min，A：B比例維持40：60不變]，流速1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃。

4 比活結(jié)果

4.1 輔料干擾試驗(yàn) 由于甘露醇與右旋糖酐20均不含氮元素，因此不會(huì)對(duì)凱氏定氮法造成影響。采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)空白輔料溶液進(jìn)行測(cè)定時(shí)，輔料溶液無(wú)紫外吸收。而采用BCA法和福林酚法時(shí)，空白輔料溶液有明顯紫外吸收，因此會(huì)影響樣品的測(cè)定，故排除BCA法和福林酚法，僅對(duì)凱氏定氮法和考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)。

4.2 方法學(xué)試驗(yàn)

4.2.1 準(zhǔn)確度 用水分別準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移5瓶供試品（批號(hào)20090709）至定氮管中，按低、中、高濃度分別精密加入10.0mg/ml的硫酸銨溶液0.5ml，1.0ml，1.5ml，參照“2.1”項(xiàng)下方法操作。所得的加樣回收率結(jié)果見(jiàn)附表1。

取供試品（批號(hào)20090709）用水溶解并稀釋成蛋白質(zhì)濃度約為250μg/ml的溶液，取該溶液1ml，分別與250μg/ml的BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品0.5ml，1.0ml，1.5ml混勻后，按考馬斯亮藍(lán)試劑盒說(shuō)明書(shū)上方法操作，所得加樣回收率的結(jié)果見(jiàn)附表2。

4.2.2 精密度

4.2.2.1 重復(fù)性 取供試品（批號(hào)20090709）5瓶，參照“2.1”項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6次，滴定蛋白氮所消耗的硫酸量的SD為0.2054，RSD為1.25%，置信度為0.95的置信區(qū)間為[16.1870，16.5972]。

取供試品（批號(hào)20090709），用水溶解并稀釋成蛋白質(zhì)濃度約為200μg/ml的溶液，參照考馬斯亮藍(lán)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法上連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得吸光度的SD為0.005，RSD為0.89%，置信度為0.95的置信區(qū)間為[0.518，0.528]。

4.2.2.2 中間精密度

附表2 考馬斯亮藍(lán)法加樣回收率測(cè)定結(jié)果

附表3 注射用糜蛋白酶的蛋白質(zhì)含量和比活結(jié)果

取供試品（批號(hào)20090709），參照“2.1”項(xiàng)下方法每天平行測(cè)定6次，連續(xù)測(cè)定3d，記錄消耗的硫酸量并計(jì)算蛋白質(zhì)含量，日間精密度RSD為0.95%。

取供試品（批號(hào)20090709），用水溶解并稀釋成蛋白質(zhì)濃度約為200μg/ml的溶液，參照考馬斯亮藍(lán)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法上每天平行測(cè)定6次，連續(xù)測(cè)定3d，記錄吸光度值并計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，日間精密度RSD為1.33%。

4.2.3 考馬斯亮藍(lán)法線性考察 照考馬斯亮藍(lán)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，日內(nèi)重復(fù)配制并測(cè)定5次，以BSA的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.0007X+0.0135，相關(guān)系數(shù)為0.9978。

4.2.4 考馬斯亮藍(lán)法耐用性 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品和供試品與考馬斯亮藍(lán)試液混合后，顏色均會(huì)隨著放置時(shí)間的增加而加深，但對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性和蛋白質(zhì)含量結(jié)果的計(jì)算并沒(méi)有影響。因此，為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，每次進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定時(shí)，都要平行繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.3 樣品測(cè)定結(jié)果 采用凱氏定氮法和考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得的蛋白質(zhì)含量結(jié)果與計(jì)算得到的比活結(jié)果見(jiàn)附表3。我們對(duì)兩種方法得到的蛋白質(zhì)含量結(jié)果進(jìn)行直線相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者存在較顯著的正相關(guān)（r=0.875，P＜0.01，n=5）。

5 純度結(jié)果

5.1 方法選擇性 本文考察了2家生產(chǎn)企業(yè)的空白輔料處方溶液，均無(wú)干擾。主成分與相鄰雜質(zhì)的色譜峰均能達(dá)到基線分離，分離度大于1.5。

5.2 破壞性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)20110316），分別加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液1.0ml、0.1mol/L鹽酸溶液1.0ml和30%過(guò)氧化氫溶液1.0ml，放置1小時(shí)，再加入0.1mol/L鹽酸溶液1.0ml、0.1mol/L氫氧化鈉溶液1.0ml和0.1%三氟乙酸水溶液1.0ml，混勻，分別作為堿、酸、氧化破壞的樣品溶液，另取同一批號(hào)樣品于60℃水浴中放置1小時(shí)，再加0.1%三氟乙酸水溶液2ml，作為熱破壞試驗(yàn)的樣品溶液。將以上溶液按“3.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果表明，樣品對(duì)堿、氧化最不穩(wěn)定，其次為酸，樣品對(duì)熱最穩(wěn)定。30%過(guò)氧化氫可使樣品直接沉淀變性。各降解產(chǎn)物與主成分峰均有良好分離，不影響純度的測(cè)定。

5.3 精密度試驗(yàn) 取“3.1.1”項(xiàng)下的糜蛋白酶對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，峰面積的RSD為0.07%。

5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“3.1.2”項(xiàng)下配制6份供試品（批號(hào)20110316）溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，樣品純度的RSD為0.11%。

5.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“5.4”項(xiàng)下供試品溶液，置4℃恒溫的Agilent 1200高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器中放置，分別于0、3、6、9、12、15、18、24小時(shí)進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，按峰面積歸一化法計(jì)算純度。8次測(cè)得的純度結(jié)果的平均值為86.59%，RSD=0.14%，說(shuō)明樣品在0.1%三氟乙酸流動(dòng)相中穩(wěn)定。

5.6 樣品測(cè)定 取樣品，照“3.1”項(xiàng)下方法配制溶液后，精密量取各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按歸一化法計(jì)算主峰的純度，各批號(hào)樣品的純度結(jié)果見(jiàn)附表4。

5.7 比活與純度結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 將凱氏定氮法得到的制劑比活與用RP-HPLC法測(cè)得的純度結(jié)果進(jìn)行直線相關(guān)性的考察，發(fā)現(xiàn)二者存在顯著的正相關(guān)，r=0.940，P＜0.01，n=5。

6 討論

6.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的選擇 通過(guò)輔料干擾試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，福林酚法和BCA法均不適用于該品種的制劑測(cè)定，而考馬斯亮藍(lán)法和凱氏定氮法無(wú)輔料干擾，可以用于注射用糜蛋白酶的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得的總蛋白質(zhì)含量明顯低于凱氏定氮法，這可能是由于反應(yīng)機(jī)制造成的，據(jù)報(bào)道[3]，采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)堿性蛋白酶酶解前后的牛血清白蛋白進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)酶解后的蛋白質(zhì)含量測(cè)定值大幅度下降，說(shuō)明當(dāng)供試品中含有混合蛋白質(zhì)和多肽時(shí)，考馬斯亮藍(lán)法僅對(duì)蛋白質(zhì)有顯色反應(yīng)。由于待測(cè)樣品是主成分與雜蛋白和雜多肽的混合物，我們要測(cè)的總蛋白量不僅包括大分子蛋白還包括樣品中的雜多肽，因此凱氏定氮法更適合注射用糜蛋白酶中總蛋白量的測(cè)定。

6.2 比活與純度的相關(guān)性考察 比活與純度結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示二者存在顯著的正相關(guān)，由于酶的提取效果越好，純度也越高，單位蛋白質(zhì)重量下的活力（即比活）也高，提高比活即提高了該酶的純度，而比活或純度值越高，酶制劑所投原料的質(zhì)量就越高。由于本品純度較高，能夠通過(guò)液相色譜方法進(jìn)行純度控制，考慮到方法的簡(jiǎn)便性，可以用純度代替比活來(lái)控制原料質(zhì)量。對(duì)于其它組分較為復(fù)雜的生化類藥物，在沒(méi)有理化手段控制樣品純度時(shí)，則可以通過(guò)測(cè)定比活來(lái)監(jiān)控制劑的投料質(zhì)量及控制純度。

7 小結(jié)

本文通過(guò)對(duì)各種蛋白質(zhì)含量測(cè)定法的篩選[4]，最終選定凱氏定氮法用于注射用糜蛋白酶中總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，并計(jì)算出比活。同時(shí)也建立了RP-HPLC測(cè)定注射用糜蛋白酶純度的方法。兩法所得結(jié)果間存在著顯著的正相關(guān)，即比活越高，純度越高。對(duì)于多組分的生化藥物，在主成分能與雜質(zhì)分離的情況下，可采用純度法來(lái)控制投料質(zhì)量，而對(duì)于成分復(fù)雜無(wú)法用理化手段控制質(zhì)量的樣品，則可考慮用比活代替純度來(lái)進(jìn)行質(zhì)量控制。