常 穎，周義義，馬延超

心力衰竭（heart failure，HF）是各種原因造成的心臟疾患（高血壓、瓣膜病、心肌梗塞等）的終末階段，主要表現(xiàn)為心功能進(jìn)行性下降。HF時(shí)心肌能量代謝異常是導(dǎo)致心功能下降的重要原因，即脂肪酸（fatty acids，F(xiàn)A）利用減少［25］，甘油三酯（triglyceride，TG）合成加速，脂質(zhì)在心臟蓄積，造成心肌細(xì)胞脂性凋亡和脂毒性心臟異常［38］。低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α）和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）分別是調(diào)控低氧適應(yīng)［27］和脂質(zhì)合成［9］的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。最近的研究發(fā)現(xiàn)，兩者在HF時(shí)均過(guò)度表達(dá)［11，16］?；蛐蛄蟹治霭l(fā)現(xiàn)［24］，HIF1可 作 用 于 PPARγ 基因的啟動(dòng)子序列并上調(diào)其表達(dá)，兩者構(gòu)成 HIF1α-PPARγ信號(hào)通路，共同參與對(duì)心肌能量代謝轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)基因與基因敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)［24］，HF時(shí) HIF1α-PPARγ信號(hào)途徑持續(xù)激活是心肌脂質(zhì)代謝紊亂并造成脂毒性心臟異常的重要原因。

Meta-分析［40］及臨床實(shí)踐［48］均顯示，耐力（有氧）訓(xùn)練可有效改善HF患者生活質(zhì)量，降低住院率與死亡率，已成為HF防治的重要康復(fù)手段之一，運(yùn)動(dòng)的良性效應(yīng)與改善HF后心肌能量代謝紊亂密切相關(guān)［45］，但具體機(jī)制未明。耐力訓(xùn)練能否下調(diào)HF時(shí)HIF1α過(guò)表達(dá)以及抑制HIF1α-PPARγ信號(hào)通路并改善心肌脂質(zhì)代謝紊亂，至今未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎腹主動(dòng)脈建立大鼠慢性HF模型，觀(guān)察10周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后心臟HIF1α、PPARγ、3-磷酸甘油脫氫酶（glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH）、磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶（glycerol phosphate acyltransferase，GPAT）基因表達(dá)、心臟脂質(zhì)代謝、心功能和運(yùn)動(dòng)能力的變化，初步探討運(yùn)動(dòng)改善HF后心肌脂質(zhì)代謝異常的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠50只，2月齡，體質(zhì)量140～150g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.2 HF模型建立、分組及心功能檢測(cè)

隨機(jī)選取30只大鼠，參照文獻(xiàn)［1］建立腹主動(dòng)脈縮窄-壓力超負(fù)荷HF模型:大鼠經(jīng)0.4%戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔麻醉后，仰臥固定，打開(kāi)腹腔，分離腎動(dòng)脈上方的腹主動(dòng)脈，在雙腎動(dòng)脈上方0.5cm處用7號(hào)（23G）針頭緊貼腹主動(dòng)脈平行放置，將兩者一起結(jié)扎，然后抽出7號(hào)針頭，即形成腹主動(dòng)脈部分狹窄。建模成功后將動(dòng)物隨機(jī)分為 HF對(duì)照組（HF組，n＝15）和 HF運(yùn)動(dòng)組（HF＋E組，n＝15）。另外20只隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組，n＝10）和假手術(shù)運(yùn)動(dòng)組（Sham＋E組，n＝10），Sham組與Sham＋E組僅分離腹主動(dòng)脈，不結(jié)扎。所有大鼠休息4周后行超聲

心動(dòng)圖檢測(cè)（方法見(jiàn)1.4），左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricularejection fraction，LVEF）≤45%為HF模型成功標(biāo)志。隨后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)，即Sham＋E組和HF＋E組進(jìn)行10周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，Sham組和HF組則保持安靜狀態(tài)。

1.3 運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定及運(yùn)動(dòng)方案制定

各組先進(jìn)行3天適應(yīng)性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，每天15min，速度為5m／s，坡度為0°。第4天測(cè)定大鼠最大有氧速度（maximal aerobic velocity，MAV），參照本課題組已建立的方案［4］:HF組和 HF＋E組先進(jìn)行15min熱身（5m／min，坡度為0°）后休息3min，再進(jìn)行遞增負(fù)荷測(cè)試，起始負(fù)荷為7 m／min，每3min遞增5m／min，坡度為0°，直到力竭，記錄MAV和力竭時(shí)間（exhaustive time，ET）。Sham組和Sham＋E組除起始負(fù)荷定為10m／min外，其他步驟同上。

Sham＋E組HF＋E組進(jìn)行為期10周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，跑速:前2周50%MAV，后8周60%MAV；時(shí)間:第1天30 min，以后每天遞增10min，直到60min／天；頻率:5天／周。Sham組和HF組保持安靜狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后再進(jìn)行一次遞增負(fù)荷力竭實(shí)驗(yàn)，記錄MAV和ET。

1.4 心功能檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后兩天，利用HP SONOS 5500型超聲儀（美國(guó)）檢測(cè)各組大鼠心功能。2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，胸部備皮，仰臥固定。探頭置于胸前，探頭頻率12MHz，圖像深度2cm。取胸骨旁左心室短軸切面進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量參數(shù)包括心率（heart rate，HR）、左心室舒張末內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室壁厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）、縮短分?jǐn)?shù)（fractional shortening，F(xiàn)S）和LVEF。

1.5 心臟取材

大鼠稱(chēng)體重（body weight，BW）后斷頭處死后取心臟，用生理鹽水沖洗，濾紙沾干，分離左右心室，分別稱(chēng)量左室重量（left ventricular weight，LVW）和 右 室 重 量 （right ventricular weight，RVW），計(jì) 算 左 室 質(zhì) 量 指 數(shù) （left ventricular mass index，LVMI）。心臟稱(chēng)重后迅速將組織置于液氮中并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存待測(cè)。

1.6 心肌 TG、FA含量

心肌TG、FA含量測(cè)定:取心肌60～80mg，加入組織裂解液，電動(dòng)勻漿后，離心10min（3500rpm），取上清，采用酶比色法測(cè)定各組吸光度（722型紫外分光光度計(jì)，上海），以標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，測(cè)定心肌TG和FA含量。試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行。心肌TG和FA含量單位為:mg／g濕重。

1.7 心肌FAβ-氧化速率（FAβ-oxidation rate，F(xiàn)OR）測(cè)定

采用同位素法測(cè)定大鼠心肌中14C-軟脂酸氧化速率。取100mg心肌剪碎后，用PBS洗滌1遍，加入到含有1.0 ml Krebs-Henseleit bicarbonate buffer和2%BSA的代謝瓶中，用100%O2沖洗2～3min，加入75μmol l-14C］-軟脂酸（0.5μCi／ml，美國(guó)Sigma公司），pH＝7.4。代謝瓶用用石蠟封口膜封緊，中央留一張 Whatman濾紙（用200μl苯乙胺打濕，作為孵育過(guò)程中生成的CO2的吸收劑），37℃孵育30min。注入H2SO4釋放CO2并繼續(xù)孵育30min以確保CO2完全被收集。將吸收14CO2的Whatman濾紙迅速轉(zhuǎn)移至20ml閃爍瓶中，加入10ml閃爍液，于LS-6500多功能液體閃爍儀（美國(guó)Beckman公司）上測(cè)定放射性。以［l-14C］軟脂酸轉(zhuǎn)化成的14CO2量來(lái)代表FOR，單位:μmmol CO2／h／g濕重。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心肌mRNA水平

利用Trizol法提取心肌勻漿液中的總RNA，用722型紫外分光光度計(jì)（上海）測(cè)定RNA濃度并測(cè)定A260／A280比值（1.8～2.0為高純度）。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。使用日本 TOYOBO公司SYBR○RGreen PCR Master-Mix試劑盒。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（7300型熒光定量PCR儀，美國(guó) Applied Biosystems公司）測(cè)定 HIF1α、PPARγ、GPDH、GPAT mRNA含量，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件:95℃／60s，1循環(huán)；95℃／15s，60℃／15s，72℃／45s，40循環(huán)。內(nèi)參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），以各組與Sham組的比值作為相對(duì)表達(dá)量。

表1 本研究引物序列一覽表Table 1 Primer Sequence

1.9 免疫印跡（Western blotting）檢測(cè)心肌蛋白水平

提取勻漿組織總蛋白后用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定各組蛋白質(zhì)含量。灌制SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%分離膠，5%濃縮膠）。上樣后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳和轉(zhuǎn)膜成功后，室溫下封閉過(guò)夜。0.01mol／L PBST洗膜后加入一抗，室溫下孵育3～4h。洗膜后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1～2h。洗膜并置于3，3’-二胺基聯(lián)苯胺（DAB）中反應(yīng)1～3min后，凝膠成像，并計(jì)算光密度值（內(nèi)參為GAPDH），以各組與Sham組的比值作為相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 樣本量

由于Sham＋E組拒跑大鼠1只，HF組和HF＋E組術(shù)后各死亡1只，HF＋E組在訓(xùn)練期間死亡3只，拒跑1只。剔除上述大鼠后，最終樣本量為43只，Sham組（n＝10），Sham＋E組（n＝9），HF組（n＝14），HF＋E組（n＝10）。

2.2 各組大鼠運(yùn)動(dòng)能力（MAV和ET）的變化

與Sham組比較，Sham＋E組 MAV和ET升高（均為P＜0.01），HF組均降低（均為P＜0.01）；與 HF組比較，HF＋E組 MAV和ET均升高（均為P＜0.01），但仍低于Sham組（均為P＜0.01，表2）。

2.3 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能的變化

與Sham組比較，Sham＋E組BW和HR降低（均為P＜0.05），LVW（P＜0.01）、LVMI（P＜0.01）、LVEDD（P＜0.01）、FS（P＜0.01）和LVEF（P＜0.05）升高，HF組BW、LVEDD、FS和LVEF降低（均為 P＜0.01），LVW、LVMI、HR和LVWT升高（均為P＜0.01）；與 HF組比較，HF＋E組 HR 降 低（P＜0.05），LVW、LVMI、LVEDD、FS和LVEF升高（均為P＜0.01，表3）。

2.4 心肌脂質(zhì)代謝的變化

與Sham組比較，Sham＋E組心肌FA、TG含量無(wú)顯著性差異（均為P＞0.05），F(xiàn)OR升高（P＜0.01），HF組FA、TG含量升高，F(xiàn)OR降低（均為P＜0.01）；與 HF組比較，HF＋E組FA、TG含量降低，F(xiàn)OR升高（均為P＜0.01，表4）。

表2 本研究各組大鼠MAV和ET比較一覽表Table 2 Comparison of MAV and ET between Each Group

表3 本研究各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能變化一覽表Table 3 Changes of Cardiac Structure and Function between Each Group

表4 本研究各組大鼠心肌脂質(zhì)代謝的變化一覽表Table 4 Cardiac Lipid Metabolism between Each Group

2.5 心肌基因表達(dá)的變化

與Sham組比較，Sham＋E組各基因表達(dá)無(wú)顯著性變化（HIF1αmRNA:0.94±0.09vs 0.98±0.08，P＞0.05；HIF1α蛋 白:0.96±0.11vs 1.01±0.09，P＞0.05；PPARγmRNA:1.03±0.08vs 1.02±0.09，P＞0.05；PPARγ蛋白:0.97±0.11vs 1.00±0.10，P＞0.05；GPDH mRNA:1.12±0.18vs 1.01±0.10，P＞0.05；GPDH蛋白:1.16±0.13vs 0.97±0.06，P＞0.05；GPAT mRNA:1.23±0.18vs 1.01±0.07，P＞0.05；GPAT 蛋白:1.17±0.12vs 0.98±0.11，P＞0.05）；HF組 HIF1αmRNA降低（0.56±0.07vs 0.98±0.08，P＜0.01）而蛋白水平升高（1.59±0.12vs 1.01±0.09，P＜0.01），PPARγ、GPDH、GPAT mRNA和蛋白水平均升高（PPARγmRNA:1.46±0.17vs 1.02±0.09，P＜0.01；PPARγ蛋白:1.79±0.22vs 1.00±0.10，P＜0.01；GPDH mRNA:1.55±0.18vs 1.01±0.10，P＜0.01；GPDH 蛋 白:1.49±0.14 vs 0.97±0.06，P＜0.01；GPAT mRNA:1.57±0.16vs 1.01±0.07，P＜0.01；GPAT 蛋白:1.69±0.20vs 0.98±0.11，P＜0.01）；與 HF組比較，HF＋E組 HIF1αmRNA升高（1.15±0.11vs 0.56±0.07，P＜0.01）而蛋白水平降低（1.20±0.10vs 1.59±0.12，P＜0.01）；PPARγ、GPDH、GPAT mRNA和蛋白水平均降低（PPARγmRNA:1.23±0.15vs 1.46±0.17，P＜0.01；PPARγ蛋白:1.36±0.19vs 1.79±0.22，P＜0.01；GPDH mRNA:1.21±0.11 vs 1.55±0.18，P＜0.01；GPDH 蛋 白:1.26±0.10vs 1.49±0.14，P＜0.01；GPAT mRNA:1.35±0.19vs 1.57±0.16，P＜0.01；GPAT 蛋 白:1.31±0.25vs 1.69±0.20，P＜0.01；圖1～圖5）。

圖1 心肌HIF1α基因表達(dá)（mRNA和蛋白水平）變化示意圖Figure 1.Change of Myocardial Gene Expression（mRNA and protein）in HIF1α

圖2 心肌PPARγ基因表達(dá)（mRNA和蛋白水平）變化示意圖Figure 2.Change of Myocardial Gene Expression（mRNA and protein）in PPARγ

圖3 心肌GPDH基因表達(dá)（mRNA和蛋白水平）變化示意圖Figure 3.Change of Myocardial Gene Expression（mRNA and protein）in GPDH

圖4 心肌GPAT基因表達(dá)（mRNA和蛋白水平）變化示意圖Figure 4.Change of Myocardial Gene Expression（mRNA and protein）in GPAT

圖5 各蛋白表達(dá)電泳圖Figure 5.Western Blotting Figure of Each Protein Expression

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠 HF時(shí) HIF1α蛋白過(guò)表達(dá)，HIF1α-PPARγ信號(hào)通路持續(xù)活化，激活了下游調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成代謝的靶基因（GPDH和GPAT），心肌細(xì)胞TG沉積，F(xiàn)A氧化利用減少，心功能降低，運(yùn)動(dòng)耐力下降；而長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練則下調(diào)HIF1α表達(dá)，抑制HIF1α-PPARγ信號(hào)通路，減少心肌脂質(zhì)積聚，F(xiàn)A氧化利用增加，心功能得到改善，運(yùn)動(dòng)耐力提高。

3.1 HF后心肌發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂

FA是正常心肌的主要能量底物（占總能量供應(yīng)的60%～70%）。低氧作為 HF的“初始觸發(fā)事件”（initial trigger）［13］，導(dǎo)致 HIF1α經(jīng)泛素-蛋白酶體降解途徑受阻，HIF1α在胞漿積聚并進(jìn)入核內(nèi)與組成性表達(dá)的HIF1β結(jié)合成完整的異二聚體HIF1而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［27］，其中，α為氧敏感的催化亞基，代表HIF1的生物活性。研究證實(shí)，HIF1是低氧反應(yīng)與適應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控?cái)?shù)以百計(jì)低氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄［27］。最近在病理性心臟肥大模型中發(fā)現(xiàn)，HIF1可作用于PPARγ基因的啟動(dòng)子序列并上調(diào)其表達(dá)［24］，而PPARγ又是調(diào)節(jié)TG合成代謝關(guān)鍵基因（GPDH和GPAT）的特異轉(zhuǎn)錄因子［9］，兩者在 HF時(shí)均過(guò)度 表 達(dá)［11，16］。糖 酵 解 中 間 產(chǎn) 物——磷 酸 二 羥 丙 酮 在GPDH作用下形成3-磷酸甘油，后者在GPAT催化下從頭合成TG［14］。因此，HIF1α-PPARγ信號(hào)途徑對(duì)于促進(jìn)心肌組織攝取FA、加速TG合成具有重要調(diào)節(jié)作用。

本研究成功建立壓力過(guò)負(fù)荷HF模型并證實(shí)了前人的結(jié)論，HF后14周心肌發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂，即與Sham組比較，HF組 HIF1α、PPARγ、GPDH 和 GPAT 蛋白表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)OR降低，心肌TG、FA堆積。FA利用減少在一定程度上降低缺血缺氧狀態(tài)下心肌的耗氧量（產(chǎn)生相同的ATP，F(xiàn)A耗氧量高于葡萄糖），在HF初期，對(duì)心功能的維持起代償作用；但在HF發(fā)展過(guò)程中，這一代償性能量代謝方式轉(zhuǎn)變可造成心肌進(jìn)一步供能不足（1mmol FFA產(chǎn)生130ATP，1mmol葡萄糖產(chǎn)生38ATP）并加重HF。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，心臟PPARγ基因過(guò)表達(dá)鼠FA攝取增加、TG在心臟蓄積并出現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病和進(jìn)行性 HF［36］，提示PPARγ過(guò)度表達(dá)可造成心臟異常。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HF患者心肌 HIF1α［16］和 PPARγ［11］表 達(dá) 升 高 并 出 現(xiàn) 明 顯的脂質(zhì)沉積［28］，而且心肌細(xì)胞間脂質(zhì)沉積與收縮功能失調(diào)及心功能衰竭有關(guān)［28］。最新的研究顯示，小鼠心臟HIF1α過(guò)表達(dá)可對(duì)早期急性心肌缺血起保護(hù)效應(yīng)，但HIF1α長(zhǎng)期激活卻可導(dǎo)致小鼠在壓力過(guò)負(fù)荷下更易發(fā)生心肌肥大和進(jìn)行性 HF［16］。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們認(rèn)為，HF后HIF1α過(guò)表達(dá)導(dǎo)致HIF1α-PPARγ信號(hào)通路持續(xù)活化并誘導(dǎo)下游脂質(zhì)合成代謝酶（GPDH和GPAT）基因表達(dá)上調(diào)，TG合成增加，心臟脂質(zhì)蓄積，同時(shí)，F(xiàn)A利用減少，心肌能量不足。心肌能量代謝紊亂直接誘導(dǎo)心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化［17］，因此，本研究中，HF組大鼠心臟出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性重塑，即“向心性心臟肥大”（與Sham組比較，HF組LVEDD下降，LVW、LVMI和LVWT升高）與收縮功能障礙（與Sham組比較，HF組FS和LVEF降低），運(yùn)動(dòng)耐力下降（與Sham組比較，HF組MAV和ET減少）。

3.2 長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練改善HF后心肌脂質(zhì)代謝紊亂

Meta-分析［40］及臨床實(shí)踐［48］均證實(shí)，規(guī)律的耐力訓(xùn)練可有效改善HF患者心功能，提高運(yùn)動(dòng)能力和生活質(zhì)量，降低住院率與死亡率，已成為防治HF的重要康復(fù)手段之一。諸多證據(jù)均提示，長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練的良性效應(yīng)與改善HF后心肌能量代謝紊亂密切相關(guān)［45］。研究顯示，一次運(yùn)動(dòng)可提高正常心肌對(duì)FA的吸收和利用［33］；而本研究證實(shí)，長(zhǎng)期規(guī)律訓(xùn)練可造成運(yùn)動(dòng)性心臟肥大（與Sham組比較，Sham＋E組LVW、LVMI和LVEDD升高），其特點(diǎn)是心肌FA氧化供能增加同時(shí)伴心功能增強(qiáng)（與Sham組比較，Sham＋E組FOR、FS和LVEF升高），這與病理性心臟肥大和HF導(dǎo)致心肌FA利用減少及心功能下降有明顯不同［7］。Burelle等［8］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)10周訓(xùn)練的正常大鼠在缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I-R）前后，F(xiàn)OR均顯著高于對(duì)照組，因此，減輕了I-R誘導(dǎo)的心肌損傷，提示運(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)正常心肌細(xì)胞FA氧化利用并具有心臟保護(hù)效應(yīng)。

有關(guān)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)HF后心肌脂質(zhì)代謝的影響報(bào)道較少，Chen等［10］以心梗家兔為 HF動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)4周有氧運(yùn)動(dòng)可顯著上調(diào)心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白（heart-type fatty acid binding protein，h-FABP）的表達(dá)水平，因此，提高了心肌對(duì)FA的利用；Kinney等［22］讓自發(fā)性高血壓大鼠運(yùn)動(dòng)16周后發(fā)現(xiàn)，心肌肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（carnitine palmitoyltransferase，CPT1，催化脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線(xiàn)粒體基質(zhì)進(jìn)行β-氧化的限速酶）活性增加并由此認(rèn)為FA利用增加。從FA代謝途徑中某個(gè)酶／蛋白基因表達(dá)的角度間接推斷，F(xiàn)A代謝的變化可能存在片面性（特別是在病理?xiàng)l件下、機(jī)體調(diào)節(jié)功能發(fā)生紊亂時(shí)），此法與直接測(cè)定FOR得出的結(jié)論并不完全一致，有時(shí)甚至是相悖的［8］，這是由于運(yùn)動(dòng)對(duì)代謝酶／蛋白的表達(dá)具有“選 擇 性 調(diào) 控”（selective regulation）［22］，運(yùn) 動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度依賴(lài)性以及組織特異性等特點(diǎn)［15］，而且這種網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控往往是錯(cuò)綜復(fù)雜的，加之FA代謝是由其攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化利用共同決定的，因此，直接測(cè)定法更為準(zhǔn)確［15］。本研究采用直接法并發(fā)現(xiàn)，10周耐力訓(xùn)練后，與HF組比較，HF＋E組心肌FA、TG含量下降，F(xiàn)OR升高，說(shuō)明耐力訓(xùn)練可促進(jìn)TG分解和FA氧化，逆轉(zhuǎn)了HF后心肌脂質(zhì)代謝紊亂的進(jìn)程。而在Kinney等［22］的研究中，自發(fā)性高血壓大鼠經(jīng)16周隨意運(yùn)動(dòng)（voluntary wheel ruuning）后，心肌FA利用增加，但心肌TG含量卻無(wú)明顯變化，可能與不同的動(dòng)物模型與運(yùn)動(dòng)方案有關(guān)。

總之，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)使HF后心肌能量代謝紊亂向著正常心肌“代謝譜”轉(zhuǎn)變，同時(shí)，心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生了相應(yīng)的變化:與HF組比較，HF＋E組左心室重量（LVW、LVMI）增加、心腔內(nèi)徑（LVEDD）增大，而室壁厚度（LVWT）無(wú)顯著性差異，這是由于有氧運(yùn)動(dòng)增加了心臟的前負(fù)荷（容量負(fù)荷），心臟出現(xiàn)“離心性肥大”，但此時(shí)心功能增強(qiáng)（與HF組比較，HF＋E組FS和LVEF增加），運(yùn)動(dòng)耐力提高（與HF組比較，HF＋E組MAV和ET增加），提示這種形態(tài)學(xué)的變化是對(duì)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)的一種生理性適應(yīng)。同時(shí)也說(shuō)明，生理性心臟肥大與病理性心臟肥大在HF運(yùn)動(dòng)康復(fù)過(guò)程中同時(shí)存在并相互抗衡，最終，前者的良性效應(yīng)逐漸逆轉(zhuǎn)了后者的負(fù)面作用，表現(xiàn)為心臟結(jié)構(gòu)由病理性肥大向生理性肥大轉(zhuǎn)變（向心性肥大轉(zhuǎn)變?yōu)殡x心性肥大），這一結(jié)論在Garciarena等［12］的研究中也得到進(jìn)一步證實(shí)，提示 HF患者在運(yùn)動(dòng)康復(fù)療法過(guò)程中，即使在原有心臟病理肥大（如高血壓造成的心臟向心性肥大）的基礎(chǔ)上出現(xiàn)離心性肥大，其堅(jiān)持有氧運(yùn)動(dòng)的收益可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于風(fēng)險(xiǎn)，但這一觀(guān)點(diǎn)尚未在人體試驗(yàn)中得到證實(shí)。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們認(rèn)為，長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練改善HF后脂質(zhì)代謝紊亂是心臟結(jié)構(gòu)性重塑發(fā)生逆轉(zhuǎn)、心功能和運(yùn)動(dòng)耐力得以提高的重要原因。

3.3 長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練改善HF后心肌脂質(zhì)代謝紊亂的機(jī)制探討

長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練對(duì)心臟保護(hù)作用的機(jī)制未明，由于HF時(shí)HIF1α-PPARγ信號(hào)途徑激活是心肌能量代謝紊亂和心功能下降的重要原因［24］，因此我們假設(shè)，長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練改善心肌脂質(zhì)代謝異?？赡芘c抑制HIF1α-PPARγ信號(hào)途徑有關(guān)聯(lián)。關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)HIF1α、PPARγ基因表達(dá)影響的研究主 要集 中 在 心 外 組 織 （骨 骼 ?。?，20，26，37］、白 色 脂 肪 組 織［34］、白細(xì)胞［31，41］等），本研究對(duì) HF大鼠長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練后心肌HIF1α和PPARγ表達(dá)的變化進(jìn)行了初步探討，并證實(shí)了上述假設(shè):HIF1α、PPARγ、GPDH和 GPAT 蛋白水平均低于HF組，說(shuō)明長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練下調(diào)心臟HIF1α過(guò)表達(dá)，抑制了HIF1α-PPARγ信號(hào)途徑持續(xù)激活對(duì)TG合成的促進(jìn)作用并減少心臟脂質(zhì)沉積。

雖然一次急性運(yùn)動(dòng)可造成局部組織缺氧并可暫時(shí)性上調(diào) HIF1α表達(dá)［21，26］，但長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練則可下調(diào) HF大鼠心肌HIF1α高表達(dá)，其原因與運(yùn)動(dòng)通過(guò)增加血管內(nèi)血流剪切應(yīng)力并誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮（nitric oxide，NO）有關(guān)［47］，NO具有血管舒張效應(yīng)并可增加心肌收縮力［47］；此外，運(yùn)動(dòng)還可增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)并促進(jìn)新生血管生成［30］，上調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子-l（peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator l，PGC-1）表達(dá)從而促進(jìn)線(xiàn)粒體生物合成［2］。因此，心臟對(duì)一次急性運(yùn)動(dòng)應(yīng)激的反應(yīng)主要體現(xiàn)在基因表達(dá)水平的變化，但不能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變和功能性適應(yīng)，而長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練是多次急性運(yùn)動(dòng)積累的效果，通過(guò)調(diào)節(jié)血管張力，降低外周阻力，改善冠脈灌注，提高有氧代謝能力等作用最終改善了心肌細(xì)胞缺氧狀態(tài)［46］，HIF1α隨之降低。由于HF時(shí)氧化應(yīng)激造成的活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多可上調(diào)HIF1α［35］，因此，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)通過(guò)下調(diào) ROS水平［43］間接參與了HF＋E組 HIF1α表達(dá)下降。而且在本研究中，HIF1α下調(diào)的同時(shí)，大鼠運(yùn)動(dòng)耐力提高，說(shuō)明長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練誘導(dǎo)的HIF1α下調(diào)提高了機(jī)體抵抗運(yùn)動(dòng)應(yīng)激的能力，這一結(jié)果在Lundby等［26］的研究中得到佐證，即受試者一次急性運(yùn)動(dòng)后骨骼肌HIF1α顯著上調(diào)，進(jìn)行4周訓(xùn)練后再進(jìn)行一次相同強(qiáng)度的急性運(yùn)動(dòng)，HIF1α表達(dá)量則較4周前顯著下降。本研究中，HF組和HF＋E組HIF 1αmRNA與蛋白水平并不同步，這可能是由于HIF1α主要受翻譯后水平調(diào)控所致，也可能與HIF1α天然反義轉(zhuǎn)錄物（natural antisense transcripts of HIF1α，αHIF）的表達(dá)有關(guān)［44］。研究證實(shí)［32］，aHIF是HIF1的靶基因，HIF1α蛋白過(guò)量表達(dá)時(shí)aHIF產(chǎn)生增多，aHIF通過(guò)降解HIF1αmRNA參與對(duì)HIF1的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

運(yùn)動(dòng)對(duì)HF后心肌PPARγ表達(dá)的影響未見(jiàn)報(bào)道。運(yùn)動(dòng)對(duì)心外組織PPARγ的表達(dá)結(jié)論不一，例如，一次運(yùn)動(dòng)和長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)均可上調(diào)正常和高血壓大鼠骨骼肌PPARγ水平［6，20，37］；14周中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)通過(guò)降低去勢(shì)大鼠腰椎骨髓細(xì)胞PPARγ表達(dá)抑制骨髓脂質(zhì)沉積［3］；4周低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可上調(diào)健康男性外周血單核細(xì)胞PPARγ表達(dá)并促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)［41］；運(yùn)動(dòng)通過(guò)上調(diào)白色脂肪組織PPARγ表達(dá)而抑制脂肪前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化［34］。而本研究則發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)下調(diào)HF后心肌PPARγ表達(dá)水平并減輕脂質(zhì)過(guò)度沉積。心外組織和心肌組織PPARγ對(duì)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的差異性表達(dá)說(shuō)明，運(yùn)動(dòng)對(duì)PPARγ表達(dá)的影響具有組織特異性，而且不同組織即使存在相同的信號(hào)通路，其作用方式也可能不同。例如，Sakurai等［34］的研究證實(shí)，白色脂肪組織存在HIF1α抑制PPARγ表達(dá)的信號(hào)途徑，運(yùn)動(dòng)則通過(guò)提高HIF1α蛋白水平而下調(diào)PPARγ表達(dá)。最近一項(xiàng)關(guān)于病理性心肌脂質(zhì)沉積的機(jī)制研究證實(shí)［28］，固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白（sterol-regulatory element binding protein，SREBP）1c也是PPARγ的轉(zhuǎn)錄因子并可上調(diào)其表達(dá)，提示運(yùn)動(dòng)下調(diào)PPARγ尚存在不依賴(lài)于HIF1α的信號(hào)途徑，但此信號(hào)途徑在長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練后的變化規(guī)律及具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，Sham＋E組各基因表達(dá)水平與Sham組無(wú)顯著性差異，但FOR增加，提示運(yùn)動(dòng)促進(jìn)正常心肌對(duì)FA利用與 HIF1α-PPARγ信號(hào)途徑無(wú)關(guān)，同時(shí)也說(shuō)明，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的基因表達(dá)不僅具有組織特異性，還與該組織的生理病理狀態(tài)有關(guān)。其機(jī)制在于，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)適應(yīng)后，心臟安靜時(shí)冠脈灌注增加，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)心臟生理性肥大的同時(shí)并不伴有心肌缺血缺氧，因此，不能誘導(dǎo) HIF1α表達(dá)上調(diào)［23］，而病理性心臟肥大始終伴隨心肌缺氧，HIF1α激活介導(dǎo)的低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑貫穿始終［23］。運(yùn)動(dòng)性心臟肥大伴心肌FA氧化利用增加可能與兒茶酚胺升高造成外周組織脂解作用增強(qiáng)［42］，活化 AMP激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）促進(jìn) FA 攝 ?。?9］，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα）表達(dá)上調(diào)增加FA代謝酶的活性和／或表達(dá)量［5］等因素有關(guān)。

最后需要強(qiáng)調(diào)的是，HF后心肌能量代謝的變化以及運(yùn)動(dòng)干預(yù)的效果與機(jī)制主要來(lái)自于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，是否可應(yīng)用于人類(lèi)疾病仍處于探索階段，其中諸多問(wèn)題尚未解決。首先，人類(lèi)疾病與動(dòng)物疾病模型的生物學(xué)基礎(chǔ)存在差異，如HF時(shí)有關(guān)心臟能量代謝的某些基因的表達(dá)和調(diào)控在人類(lèi)和動(dòng)物存在顯著差異［18］，而且臨床上HF患者心肌能量代謝的特點(diǎn)是FA利用增加而葡萄糖利用減少［39］，與動(dòng)物模型恰好相反；其次，人類(lèi)疾病還受到共存疾?。╟omorbidity）或并發(fā)癥（complication）以及環(huán)境因素（飲食、藥物、體力活動(dòng)等）的影響。因此，本研究所探討的長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練對(duì)HF大鼠脂質(zhì)代謝的影響及其機(jī)制只適用于此動(dòng)物模型，而從動(dòng)物研究應(yīng)用到人類(lèi)疾病的治療則需要一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，今后的研究應(yīng)以HF患者為研究對(duì)象，結(jié)合新的微創(chuàng)甚至無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)（如心臟磁共振、PET-CT等［29］），繼續(xù)探索耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌能量代謝的影響與機(jī)理，為HF患者運(yùn)動(dòng)康復(fù)提供最直接的研究證據(jù)。

4 結(jié)論

1.HF時(shí)HIF1α-PPARγ信號(hào)通路持續(xù)激活，其下游調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成代謝的靶基因如GPDH和GPAT表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞脂質(zhì)沉積，同時(shí)，伴FA氧化利用減少，心功能和運(yùn)動(dòng)耐力下降；

2.長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)促進(jìn)正常心肌對(duì)FA氧化利用，其機(jī)制與HIF1α-PPARγ信號(hào)途徑無(wú)關(guān)；

3.長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練抑制慢性 HF大鼠心臟 HIF1α-PPARγ信號(hào)通路并下調(diào)其下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)FA氧化利用，減少心肌脂質(zhì)沉積，從而改善心功能并提高運(yùn)動(dòng)耐力。

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