付德榮，孫小華，劉承宜，廖八根，李鵬博，田禎祥

糖尿病是繼心腦血管疾病、腫瘤之后嚴重危害人類健康的第三大類疾病。胰島素（Insulin，INS）抵抗和／或分泌缺陷是2型糖尿?。═ype 2diabetes mellitus，T2DM）的基本病因。骨骼肌是INS作用的主要靶組織，其占人體重量的40%～50%，正常情況下，75%以上的INS介導的糖代謝由骨骼肌完成［30］。近年研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌的慢性炎癥與INS抵抗和T2DM 的發(fā)生密切相關［30，33］。肥胖或糖尿病患者，骨骼肌通過旁分泌、自分泌及內分泌的效應產生腫瘤壞死因子-ɑ（tumor necrosis factorɑ，TNF-ɑ）、C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、核轉錄因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等多種炎癥介質，引發(fā)骨骼肌慢性炎癥反應。TNF-ɑ、NF-κB及MCP-1等介質通過直接或間接效應抑制INS信號通路，導致糖的轉運和利用障礙［25，30］，后者又促進INS抵抗和T2DM病情發(fā)展，進一步加重骨骼肌的炎癥程度，形成惡性循環(huán)。

谷氨酰胺（glutamine，Gln）是人體免疫細胞的主要能源底物，也是體內大多數(shù)細胞的能源物質，主要在骨骼肌合成 并95%以上儲存在骨骼?。?2，15，29］。作為谷胱甘肽（glutathione，GSH）的前體，Gln補充可提高體內GSH含量，增加機體抗氧化能力，抑制NF-κB的活性，降低活性氧的產生，降低中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）對組織的浸潤［15］。同時，補充Gln還可增加正常人、肥胖及T2DM患者循環(huán)中血清胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）的水平［6］。GLP-1是一種快速強力刺激餐后INS釋放的腸道激素，GLP-1刺激INS分泌的形式呈血糖依賴性［5］，并抑制胰高血糖素的分泌和胃的排空［3，6］，發(fā)揮降血糖效應。肥胖及T2DM患者體內Gln減少［13，31］。

有氧運動是預防和治療糖尿病的基礎。運動在降低體脂的同時可改善骨骼肌質量，增加骨骼肌糖脂代謝的關鍵調節(jié)物葡萄糖轉運體蛋白-4（Glucose transporter isoform 4，GLUT4）及過氧化物酶激活體γ共激活物-1（peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1，PGC-1）的表達，加速糖脂代謝；提高抗氧化酶黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）、GSH、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等的含量，增強抗氧化能力［26］；促進骨骼肌抗炎因子白介素 6（einterleukin-6，IL-6）［7，32］和 NF-κB 抑制蛋白（protein inhibitorκB，IκB）的表達［24］，IL-6強烈抑制 TNF-ɑ表達［7，32］，IκB抑制 NF-κB活性［24］，減輕骨骼肌炎癥反應 程度；增加GLP-1的分泌量［11］，降低血糖。運動量即運動強度乘運動時間對T2DM患者的治療至關重要。大運動量可顯著增加INS的敏感性，降低糖基化血紅蛋白濃度，而低運動量無效［20］。

鑒于以上情況，本研究設想給予T2DM大鼠長期有氧運動聯(lián)合Gln補充，對改善骨骼肌慢性炎癥狀態(tài)、降低血糖、提高GLP-1及INS水平將起協(xié)同效應，而目前有關這方面的研究尚未見報道。因此，本研究擬定T2DM大鼠進行6周的無負重游泳運動，同時飼料中添加2%Gln，探討有氧運動及Gln補充聯(lián)合作用時對T2DM大鼠空腹血糖（fasting blood-glucose FBG）、INS、GLP-1及骨骼肌炎癥因子NF-κB、MPO及MCP-1基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠60只（廣州中醫(yī)藥大學實驗中心提供），179.8±19.2g，3～4只／籠，在溫度23℃±2℃、濕度50%±5%、明暗周期各12h（8:30～20:30光照）的動物房內飼養(yǎng)。

1.2 實驗方案

所有大鼠1周適應性飼養(yǎng)后隨機分為健康對照組（C組，26只，212.8±10.9g）和糖尿病造模組（D組，34只，220.4±25.6g），兩組大鼠體重差異無顯著性。C組給予普通飼料（標準嚙齒類動物飼料）飼養(yǎng)，D組給予高脂膳食（豬油10%，蛋黃粉8%，蔗糖20%，膽酸納0.1%，基礎飼料61.9%）。飼養(yǎng)4周后D組大鼠一次性腹腔注射35 mg／kg鏈脲佐菌素（streptozotocin STZ，sigma），72h后尾靜脈取血測大鼠FBG值，血糖≥16.7mmol／L為T2DM成模標準，血糖≤16.7mmol／L再補充15mg／kg腹腔注射，3日后4只未成模大鼠剔除。

造模成功后兩組大鼠再進一步隨機分為:安靜組（CQ，DQ）、運動組（CE，DE）、Gln組（CG，DG）、運動加 Gln組（CEG，DEG）（表1）。運動組大鼠進行游泳運動（水溫30℃±2℃），第1周前3日15min／次，后3日30min／次，第2周前3日45min／次，后3日60min／次，第3～6周60 min／次，6次／周。運動過程中如有疲勞現(xiàn)象（數(shù)秒內未迅速浮上水面），即刻拿出休息5～10min，恢復后再繼續(xù)完成訓練時間。Gln組大鼠飼料添加2%（w／w）的L-Gln。

表1 本研究大鼠分組一覽表Table 1 Groups of Animals

1.3 取材

第6周訓練結束48h后對所有大鼠進行取材。訓練過程中大鼠溺水死亡3只，疾病死亡2只（DE組1只，腸腔多發(fā)腫瘤；DEG組1只，頸部膿腫?？紤]為糖尿病免疫低下所致），自然死亡1只（CEG組，未見任何異常）。取材前大鼠禁食12h，禁水4h。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后腹主動脈取血，分離血清后-80℃保存。迅速剝離雙側腓腸肌內側頭，取中1／3段，剔除表層筋膜及與之相連的淺層肌肉，然后入液氮備用。

1.4 檢測指標

1.4.1 血液指標

FBG采用Super GLUCOTM血糖儀測定；INS及GLP-1采用酶聯(lián)免疫法測定（試劑盒購自上海藍基生物科技有限公司ShangHai BlueGene Biotech CO.，LTD）。

1.4.2 基因表達

采用實時定量PCR（real-time PCR）檢測骨骼肌NF-κB、MPO及MCP-1mMRA的表達。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。目的基因NF-κB:Forward primer CTC AAG AAC AGC AAG GCA AGC AC，Reverse primer AGA GGT GTC GTC CCA TCG TTA GG G。目的基因 MPO:Forward primer CCC ATC CAC CAT GCT TTA TTA G，Reverse primer ACA ACA CTG GCA TCA CTA CCG T。目的基 因 MCP-1:Forward primer ATG CAG TTA ATG CCC CAC TC，Reverse primer TTC CTT ATT GGG GTC AG CAC。內參基因18SrRNA:Forward primer CAT TCG AAC GTC TGC CCT ATC A，Reverse primer GGG TCG GGA GTG GGT AAT TTG。

RNA抽提:1）50mg骨骼肌中加入預冷的1ml Trizol reagent，充分勻漿。2）冰上靜置5min，加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15sec，冰上放置10min。3）4℃12000g離心15min。4）上清液轉移1.5mlEP管中，加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫靜置10min。5）4℃12000g離心10min。6）棄上清，加入1ml 75%乙醇溶液（DEPC水配制）洗滌沉淀。7）4℃7500g離心5min。8）棄去乙醇，室溫干燥15 min，加入30μL DEPC處理水溶解。

cDNA第一鏈合成:1）取總RNA 1μg，按反轉錄試劑盒（Takara PrimeScriptTM RT reagent Kit）操作指南依次加入5xPrimeScriptTM Buffer 2 μL，PrimeScriptTM RT Enzyme MixI 0.5μL，Oligo dT Primer（50μM）0.5μL，Random 6 mers（100μM）0.5μL，RNase Free dH2O 補足10μL。2）反應條件:37℃15min，85℃5min。cDNA產物-80℃保存。

PCR擴增:按熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa SYBR○RPremix Ex TaqTMII）操作指南配制PCR反應液，總體系為25μL:SYBR○RPremix Ex TaqTMII（2x）12.5μL，PCR Forward Primer（10μM）1μL，PCR Reverse Primer（10μM）1 μL，cDNA 1μL，補ddH2O至25μL。

PCR循環(huán)條件:95℃預變性10min；95℃變性10 sec；60℃ 退火20sec；72℃延伸 15sec；共35～38個循環(huán)，最后72℃延伸5min。

1.5 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據用SPSS 17.0軟件進行處理。數(shù)據用均數(shù)±標準差（D）表示。資料先用固定模型多因素方差分析檢查高脂飲食、Gln補充與運動之間的主效應及三者間的交互影響。如有交互影響則分別在固定單因素或雙因素水平后用獨立樣本t檢驗檢查另一因素的效應；如有主效應但無交互影響則進一步用單因素方差分析組間差異。差異具顯著性水平P＜0.05，差異具非常顯著性水平P＜0.01。

2 結果

2.1 大鼠FBG、GLP-1及INS的變化

2.1.1 大鼠FBG的變化

高脂膳食、運動及谷氨酰胺補充對大鼠FBG均有明顯影響作用，且高脂膳食與Gln補充、高脂與運動間存在交互影響。長期高脂喂養(yǎng)的DQ組大鼠FBG值顯著高于普通飼料喂養(yǎng)CQ組大鼠。長期游泳運動可明顯降低CE組和DE組大鼠的FBG。長期Gln補充顯著降低DG組大鼠FBG值，但對CG組大鼠FBG影響不明顯。運動聯(lián)合Gln補充時，可顯著降低DEG組大鼠FBG值，并較單純運動（DE組）或 Gln補充（DG組）時明顯，但對CEG組大鼠FBG影響不明顯（表2）。

2.1.2 大鼠血GLP-1的變化

高脂膳食、運動及谷氨酰胺對大鼠血清GLP-1均有明顯影響作用，且相互間有明顯交互影響。高脂喂養(yǎng)的DQ組大鼠血清GLP-1水平顯著低于普通飼料喂養(yǎng)的CQ組大鼠。長期游泳運動明顯增加DE組大鼠GLP-1濃度，對CE組大鼠GLP-1影響不明顯。長期Gln補充明顯增加DG組大鼠GLP-1水平，對CG組大鼠GLP-1無明顯影響作用。當運動聯(lián)合Gln補充時，可顯著增加CEG組和DEG組大鼠的GLP-1水平，對DEG組大鼠的影響較單純運動（DE組）或Gln補充（DG）時顯著，對CEG組大鼠的影響較單純Gln補充（CG組）時顯著，與單純運動（CE組）時比較差異不明顯（表2）。

2.1.3 大鼠血INS水平的變化

有氧運動、Gln補充及高脂膳食對大鼠空腹INS均有明顯影響作用，但三者間無明顯交互影響。DQ組大鼠空腹INS水平顯著低于CQ、CE、CG及CEG組大鼠。長期游泳運動明顯升高DE組和CE組大鼠的INS水平。長期Gln補充顯著升高DG組大鼠INS水平，對CG組大鼠影響不明顯。運動聯(lián)合Gln補充時，顯著增加DEG組大鼠的INS水平（顯著高于DQ組），與單純運動（DE組）或Gln補充（DG組）比較有進一步增加的趨勢，但差異不顯著。二者聯(lián)合對正常組CEG組大鼠INS水平的影響不明顯（表2）。

表2 本研究6周游泳運動及Gln補充對大鼠血INS、GLP-1及FBG的影響一覽表Table 2 Effects of 6Weeks Swimming and Glutamine Supplement on Blood INS、GLP-1and FBG of Rats

2.2 大鼠骨骼肌NF-κB、MPO及 MCP-1mRNA的表達

2.2.1 大鼠骨骼肌 NF-κB mRNA的表達

長期高脂喂養(yǎng)的T2DM組大鼠骨骼肌NF-κB mRNA的表達顯著高于正常組大鼠。長期游泳運動對DE組大鼠和CE組大鼠骨骼肌NF-κB mRNA表達均呈明顯抑制效應。長期Gln補充顯著抑制DG組大鼠NF-κB mRNA的表達，對CG組無明顯影響。運動聯(lián)合Gln補充降低DEG組大鼠骨骼肌NF-κB mRNA表達的效應顯著高于單純Gln補充（DG組）的作用，但與單純運動（DE組）比較差異不顯著。二者聯(lián)合對CEG組大鼠骨骼肌NF-κB mRNA表達的影響與單純運動（CE組）或單純Gln補充（CG組）比較無差異。單純運動（CE組和DE組）與單純Gln補充（CG組和DG組）比較，對大鼠骨骼肌NF-κB mRNA的表達影響無明顯差異（表3）。

2.2.2 大鼠骨骼肌 MPO mRNA的表達

運動、Gln補充及高脂膳食對大鼠骨骼肌MPO mRNA的表達均有顯著影響作用，且三者間存在交互影響。高脂喂養(yǎng)的DQ組大鼠骨骼肌MPO mRNA的表達顯著高于正常喂養(yǎng)的CQ組大鼠。長期有氧運動或Gln補充均可明顯降低T2DM大鼠（DE組與DG組）及正常大鼠（CE組和CG組）骨骼肌MPO mRNA的表達量，運動聯(lián)合Gln補充對CEG組和DEG組大鼠MPO mRNA表達的影響與單純運動（CE組和DE組）或單純Gln補充（CG組和DE組）時相似（表3）。

2.2.3 大鼠骨骼肌 MCP-1mRNA的表達

運動、Gln補充及高脂膳食對大鼠骨骼肌MCP-1mRNA的表達均有顯著影響作用，且運動與Gln補充、Gln補充與高脂膳食間存在交互影響。長期高脂喂養(yǎng)的DQ組大鼠骨骼肌MCP-1mRNA的表達顯著高于正常喂養(yǎng)的EQ組大鼠。有氧運動或Gln補充均可明顯降低T2DM（DE組和DG組）及正常大鼠（CE組和DE組）骨骼肌MCP-1mRNA的表達量，運動聯(lián)合Gln補充對DEG組大鼠MCP-1mRNA表達的影響與單純Gln補充（DG組）相似，但明顯高于單純運動（DE組）的影響，對CEG組的影響與單純運動（CE組）或Gln補充（CG組）的效果相似（表3）。

表3 本研究6周游泳運動及Gln補充對大鼠骨骼肌NF-κB、MCP-1及MPO基本表達的影響一覽表Table 3 Effects of 6Weeks Swimming and Glutamine Supplement on NF-κB，MCP-1and MPO mRNA Expression of Rats Muscle

3 分析與討論

高脂喂養(yǎng)誘導大鼠肥胖后再給予小劑量STZ注射是T2DM造模的常用方法［2，23］。本實驗成膜后的大鼠血糖顯著升高，多飲多食多尿現(xiàn)象明顯，符合T2DM特點。6周的實驗干預后，T2DM安靜組大鼠骨骼肌NF-κB、MCP-1及MPO的mRNA表達量顯著高于安靜對照組，說明本實驗T2DM大鼠存在明顯的骨骼肌炎癥情況，與 Wei等［30］和Zeyda等［33］的研究顯示。慢性炎癥是胰島素抵抗及T2DM 發(fā)病的 關 鍵 因 素［30，33］。NF-κB是 炎 癥 通 路 的 主 要調節(jié)因子，NF-κB的激活在骨骼肌INS抵抗中起重要作用［24，25］。正 常情 況 下 ，NF-κB 與IκB 結 合 位 于 胞 漿 。 細 胞因子、活性氧、高血糖以及脂肪酸等可激活IκB激酶（IκB kinase，IKK），IKK 磷 酸 化IκB，磷 酸 化 的IκB 繼 續(xù) 被 泛 素化，最后通過蛋白水解酶降解，NF-κB被釋放轉位進入胞核。在胞核中NF-κB控制炎癥因子 TNF-ɑ、MCP-1、IL-1等的轉錄水平，并磷酸化INS受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）而抑制INS信號通路和介導炎癥蛋白表達［25］。趨化因子 MCP-1廣泛存在于不同類型的細胞中，多種刺激可促進 MCP-1的表達增加［16］。T2DM患者骨骼肌 MCP-1顯著增加［16，30］，本實驗顯示了相似的結果。MCP-1趨化大量巨細胞進入骨骼肌和脂肪細胞中，誘導骨骼肌和脂肪組織的慢性炎癥［27，30］。骨骼肌對 MCP-1高度敏感，少量的MCP-1即可抑制INS信號通路和減少骨骼肌對糖的攝取。因此，MCP-1被認為是引起INS抵抗的骨骼肌和脂肪組織交叉對話聯(lián)系的關鍵分子［21，30］。釋放入血的MCP-1濃度則與糖基化血紅蛋白密切正相關［17］。MPO由多核性粒細胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）分泌并促進PMN遷移進入靶部位［9］。MPO可利用氯化物和過氧化氫產生有抗菌作用的次氯酸（hypochlorous acid，HOCl），即 MPO-H2O2-Cl-系統(tǒng)，這在正常機體的免疫防御中起重要作用。病理情況下，持續(xù)激活的MPOH2O2系統(tǒng)將引起組織損傷，HOCl引起靶組織的硝化、鹵化和氧化反應，引發(fā)和加重炎癥病變［10］。阻斷 MPO的活化位點、抑制氯化物的形成、使用氧化抑制劑和裂解次氯酸阻止炎癥復合物的形成和播撒已被作為新的方法用于相關疾病的治療［10］。本實驗中T2DM大鼠FBG明顯增加，而ISN顯著降低，說明升高的NF-κB mRNA和 MCP-1 mRNA對大鼠ISN的分泌產生了明顯的抑制，而MPO的增加可能進一步加重骨骼肌的炎癥損傷，造成惡性循環(huán)。

規(guī)律運動是預防和治療T2DM的關鍵［1，7，24］。本實驗顯示，6周的游泳運動明顯降低了T2DM大鼠骨骼肌NF-κB、MCP-1及MPO的基因表達，增加了ISN水平，降低了FBG值。Golbidi等［7］及 Sriwijitkamol等［24］報道，運動可明顯增加抗炎因子IL-6的表達，IL-6抑制炎癥因子TNF-ɑ和IL-1β的產生，并刺激抗炎因子IL-10和IL-1ra的分泌；增加IκB表達，抑制 NF-κB的活化［24］；并可通過升高的腎上腺素直接抑制TNF-ɑ的反應［7］。有氧運動還可顯著降低 MCP-1的 表 達［14，22，28］，減少機體感染后MCP-1的 上 升幅度［22］，降低癌癥大鼠體內 MCP-1的含量，且降低的程度與腫瘤減少程度呈正相關［14］。骨骼肌炎癥狀態(tài)的改善提高了T2DM大鼠骨骼肌對ISN的敏感性，同時增加了ISN分泌，加強了骨骼肌糖脂代謝的能力［7］，降低了FBG值，有利于T2DM病情的改善。6周游泳運動對正常大鼠骨骼肌NF-κB、MCP-1及MPO的表達亦有明顯的抑制效應，并降低了其FBG，提高了ISN水平，這正是長期有氧運動不僅是T2DM治療的必要手段，也是預防代謝類疾病及其他疾病發(fā)生的最佳行為方式［1，23］。6周游泳運動增加了T2DM大鼠的GLP-1水平，但對正常大鼠無影響，說明運動調節(jié)GLP-1與GLP-1刺激INS分泌的糖依賴形式相一致，對失穩(wěn)態(tài)水平的GLP-1有明顯調節(jié)作用，而對正常穩(wěn)態(tài)的GLP-1無明顯影響，這提高了運動降血糖的安全性。

Gln是人體最豐富的游離a-氨基酸，占血漿游離氨基酸的20%，其每天以80g的速度快速更新［29］。創(chuàng)傷、感染、手術等應激情況及高分解代謝疾病狀態(tài)下，體內Gln被快速動用，血液和組織中Gln迅速下降甚至耗竭，機體抗氧化能力及細胞免疫能力下降，腸粘膜受損，骨骼肌蛋白分解增加，臨床愈后情況與細胞外Gln濃度直接相關。外援性補充Gln后可明顯逆轉上述情況，改善病情，降低死亡率，因此 Gln被廣泛用于臨床多種疾病的 治療［4，12，15］。T2DM患者Gln明顯減少［13］。給予T2DM患者Gln補充不僅可提高機體的抗氧化能力，而且顯著增加GLP-1的水平，增加INS濃度，降低餐后早期高血糖的發(fā)生率［6，19］。目前，使用GLP-1類似物或激動劑提高GLP-1的分泌量已成為T2DM患者最安全有效的治療方法［5，8］。本實驗顯示，6周Gln補充可降低T2DM大鼠 MPO、NF-κB及 MCP-1的mRNA表達，抑制正常大鼠MPO、MCP-1的mRNA表達，但對正常大鼠NF-κB mRNA的表達無明顯影響，說明Gln補充可明顯抑制中性粒細胞和巨噬細胞對骨骼肌的浸潤，減少T2DM大鼠骨骼肌的炎癥性損傷，提高正常大鼠骨骼肌的抗炎能力，這個過程在沒有影響NF-κB的情況下同樣有效。Gln補充顯著增加T2DM組大鼠GLP-1及INS水平，降低其FBG值，但對正常大鼠的影響均不明顯，說明長期飲食中添加Gln可明顯改善T2DM大鼠血糖調節(jié)的內穩(wěn)態(tài)失衡情況，而不影響正常狀態(tài)下的血糖調節(jié)，因此Gln的補充既有效又安全。

有氧運動聯(lián)合Gln補充對T2DM大鼠骨骼肌炎癥因子及其FBG、ISN及GLP-1的影響是否有協(xié)同效應，目前，據我們所查尚未見報道。本實驗顯示，6周的游泳聯(lián)合Gln補充（DEG組）抑制T2DM大鼠NF-κB mRNA表達的效應顯著高于單純Gln補充（DG組），但與單純運動（DE組）相似，對 MCP-1mRNA的抑制與單純Gln補充（DG組）相似，但明顯高于單純運動（DE組）的效應，對 MPO mRNA表達的影響與單純運動（DE組）或單純Gln補充（DG組）時相似，降低大鼠FBG、增加GLP-1作用較單純運動（DE組）或Gln補充（DG組）時明顯，增加ISN的效應與單純運動（DE組）或Gln補充（DG組）相似。因此，二者的聯(lián)合效應優(yōu)于運動或Gln補充單因素作用時的效應。這可能與T2DM機體降低的Gln水平［13］得到了補充，并隨運動時骨骼肌血流量的增加，骨骼肌獲取了更多的能源底物，增加了抗氧化物質的合成，且Gln補充促進更多的GLP-1的合成有關。

4 小結

骨骼肌的慢性炎癥與INS抵抗和T2DM發(fā)病密切相關。抑制骨骼肌炎癥、提高機體對INS的敏感性是近年來治療T2DM的新途徑。運動和飲食干預是治療T2DM的最基本方式。本實驗顯示長期有氧運動或Gln補充可顯著降低T2DM大鼠骨骼肌炎癥因子 MPO、NF-κB及 MCP-1的mRNA表達，提高GLP-1及INS的水平，降低FBG，當二者聯(lián)合作用時，對T2DM大鼠的效應較單純運動或Gln補充時明顯。因此，建議T2DM患者要長期堅持規(guī)律的有氧運動，并注意飲食中Gln的補充。

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