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        MALDI-TOF-MS 技術(shù)篩查原發(fā)性小肝細胞癌血清特異蛋白

        2012-10-17 08:20:52何偉華獨建庫孫高斌高春芳
        實用醫(yī)藥雜志 2012年12期
        關(guān)鍵詞:肝癌

        李 珂,何偉華,趙 光,獨建庫,孫高斌,彭 玲,高春芳

        基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization-time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技術(shù)主要應(yīng)用在蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組學研究并直接獲取某種疾病的特征性生物學標記。目前,利用MALDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)腫瘤的特殊生物學標記,對多種腫瘤的早期診斷研究中顯示出良好的應(yīng)用前景[1-6]。原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)是國內(nèi)外最常見的惡性腫瘤之一,肝癌在我國的發(fā)病率及病死率有逐年增高的趨勢[7,8]。中晚期肝癌診斷并不困難,但臨床治療預(yù)后不佳,故肝癌早期診斷即小肝癌診斷對肝癌治療及預(yù)后起著至關(guān)重要的作用,也一直被臨床和科研工作者所關(guān)注。尋找具有高靈敏度和高特異性的原發(fā)性肝癌特異性腫瘤標志物則是原發(fā)性肝癌早期診斷的關(guān)鍵所在。運用MALDI-TOF-MS技術(shù)對原發(fā)性小肝癌患者與正常人血清蛋白質(zhì)譜進行分析,得到高敏感性和特異性的血清蛋白,建立小肝癌診斷模型指紋圖譜,為肝癌的臨床治療及預(yù)后評估提供更積極的因素。

        1 資料與方法

        1.1 對象及分組 選取解放軍第150醫(yī)院2007-09~2009-12收治的小肝癌患者35例 (均未做任何干預(yù)性治療),影像學報告肝腫瘤直徑<5 cm(以2001年中華醫(yī)學會定義小肝癌標準,不嚴格區(qū)分微小肝癌與小肝癌),且超聲引導經(jīng)皮穿刺活檢病理診斷報告為原發(fā)性肝癌;男23例,女12例,男女比例 1.92∶1;年齡 27~79 歲,平均 56 歲;按照 TNM 標準進行分期,Ⅰ期34例,Ⅱ期1例;按照Child-Pugh分級標準,A級30例,B級5例;甲胎蛋白(AFP)<20μg/L 者 5例, 20~200μg/L者 17例,>200μg/L者13例;有乙型肝炎、肝硬化病史29例。正常對照組共50名,為2007-09~2010-09健康體檢者,男 31名,女 19名,男女比例 1.6∶1;年齡 25~83歲,平均58歲(對照組年齡與小肝癌組年齡無統(tǒng)計學差異);AFP正常,均無肝炎及肝硬化病史。

        1.2 試劑儀器及方法

        1.2.1 試劑儀器 試劑為銅螯合磁珠懸浮液、銅螯合磁珠結(jié)合緩沖液 (BS)、銅螯合磁珠清洗緩沖液(WS)、銅螯合磁珠洗脫緩沖液(ES)基質(zhì)(3mg/ml CHCA,50%ACN,2%TFA)等。 儀器為 Eppendorf公司的磁珠分離器、微量加樣槍、高速臺式離心機、SCOUT-MTP樣品靶、AUTOFLEX TOF/TOF質(zhì)譜儀及Revco公司的超低溫冰箱、通風櫥等。

        1.2.2 方法 患者空腹抽取肱靜脈血2~3ml于普通干燥管中,4 ℃冰箱內(nèi)靜置 2 h,離心(2000 r/min,10~20min),取上清按 100μl/管分裝標記,置于-70℃超低溫冰箱保存。樣品靶、血清樣品進行結(jié)合前生化處理后,血清蛋白與標準靶進行結(jié)合:取樣品10μl置于1.5ml離心管中,混勻磁珠懸浮液后取出5μl磁珠加入樣品管,再加入50μl銅螯合磁珠結(jié)合緩沖液(BS),將樣品管放入磁珠分離器,在前后相鄰兩孔間反復(fù)移動樣品管10次混勻;分離后用加樣槍小心吸去樣品管中的溶液,向樣品管中加入20μl銅螯合結(jié)合緩沖液使磁珠重新懸浮、分離;再向樣品管中加入100μl銅螯合磁珠清洗緩沖液 (WS),在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復(fù)移動樣品管10次混勻;向樣品管中加入10μl銅螯合磁珠洗脫緩沖液(ES)混勻,磁珠與洗脫液分離,用加樣槍小心將洗脫下來的多肽樣品溶液移入干凈的0.5ml樣品管;點1μl洗脫樣品及1μl基質(zhì)于樣品靶。

        1.2.3 質(zhì)譜檢測 將制備好的SCOUT-MTP樣品靶通過AUTOFLEX TOF/TOF質(zhì)譜儀檢測口放入質(zhì)譜儀內(nèi)部托盤并固定。啟動激光系統(tǒng)提供脈沖激光,擊打樣品靶點,通過flex Control的Setup設(shè)置儀器參數(shù),當激光開始脈沖時,數(shù)字轉(zhuǎn)換器記錄由檢測器檢測到的模擬信號,并將它們轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。采集系統(tǒng)運用FlexControl軟件,設(shè)定激光能量、譜圖評估參數(shù)、譜圖疊加次數(shù)、靶的移動方式和范圍等參數(shù)。

        1.2.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析系統(tǒng)采用FlexAnalysis和BioTools兩組軟件,分組調(diào)入樣品數(shù)據(jù)建立模型,實驗選擇線性模式,再設(shè)定參數(shù)選擇算法,包括快速分類法(quick classifier,QC)、遺傳算法(genetic algorithm,GA)、支持向量機法(support vector machine,SVM)及監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(supervised neural network,SNN)等,運算后顯示統(tǒng)計分析結(jié)果并進行交叉驗證。

        2 結(jié) 果

        2.1 蛋白質(zhì)譜波峰的整合分析 軟件FlexAnalysis和BioTools分析結(jié)果顯示:蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(M/Z)在0~100000Da范圍內(nèi)(共 169 個 Index),小肝癌組與正常人組有差異的蛋白質(zhì)峰為55個(P<0.05,表1),兩組有顯著性差異的蛋白質(zhì)峰為30個(P<0.01)。

        2.2 分類結(jié)果 小肝癌組和正常對照組血清樣品的蛋白質(zhì)波譜進行比較,根據(jù)GA得到的蛋白質(zhì)如表2所示,SVM得到的蛋白質(zhì)如表3所示,QC得到的蛋白質(zhì)如表4所示,SNN所得的蛋白質(zhì)如表5所示。

        2.3 交叉驗證 通過交叉驗證(表6)及識別能力檢測 (表7)顯示GA較其它三種算法結(jié)果可信度高。GA識別的M/Z值為7771.17Da的蛋白質(zhì)較具有較高敏感性和特異性,可將正常人及小肝癌患者準確分開。

        2.4 確定診斷模型蛋白 運用MALDI-TOF分析結(jié)果顯示,M/Z值為7771.17 Da的蛋白質(zhì)作為診斷原發(fā)性小肝癌的特異性蛋白可將正常人及小肝癌患者準確分組,具有高敏感性和特異性。且M/Z值為7771.17Da蛋白質(zhì)在小肝癌組中低表達,在正常人組中高表達。

        2.5 特異性及敏感性的相關(guān)分析 運用Flex Analysis和BioTools軟件進行分析,M/Z值為7771.17Da的蛋白質(zhì)作為診斷原發(fā)性小肝癌的特異

        性蛋白,其敏感性為91.0%,特異性為70.0%。

        表1 小肝癌組與正常人對照組有55個差異蛋白質(zhì)

        表2 GA結(jié)果

        表3 QC結(jié)果

        表4 SVM結(jié)果

        表5 SNN結(jié)果

        表6 交叉驗證

        表7 識別能力檢測

        3 討 論

        肝癌早期診斷即小肝癌診斷對肝癌治療及預(yù)后起著至關(guān)重要的作用,肝癌的早期篩查有助于降低肝癌病死率[9]。近年,隨著實驗室技術(shù)及影像診斷技術(shù)的發(fā)展,原發(fā)性肝癌的診斷已經(jīng)從“臨床診斷”進展到“亞臨床診斷”。20世紀70年代初,甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)的臨床應(yīng)用使肝癌診斷向前邁進了一大步。然而,大量臨床資料表明肝癌患者AFP陽性率波動于60%~70%[10],小肝癌中血清AFP陰性的肝癌患者也較常見[11],且部分肝癌患者病程中AFP值呈持續(xù)低濃度陽性。同時,正常妊娠、活動性肝炎、生殖系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)的惡性腫瘤等血清AFP值亦升高。以上表明甲胎蛋白在原發(fā)性小肝癌診斷的實際應(yīng)用中,存在相當程度的陰性及假陽性問題。20世紀80年代,超聲(ultrasonic)、計算機斷層攝影(CT)、核磁共振成像(MRI)等影像診斷技術(shù)的應(yīng)用使肝癌的亞臨床診斷成為可能。同樣,以上任何一種影像診斷技術(shù)都受到儀器性能、腫瘤發(fā)展程度、影像學技師技能、臨床經(jīng)驗等因素的影響,且影像診斷篩查結(jié)果最終需得到病理診斷的進一步支持。

        近期,關(guān)于肝癌的基礎(chǔ)研究也是十分活躍據(jù),然而肝癌發(fā)生的機理十分復(fù)雜,至今發(fā)現(xiàn)的基因和蛋白質(zhì)表達異常雖然多見,但尚未據(jù)此形成更為可靠的預(yù)測手段[12]。生命科學進入后基因組時代為科研工作者提供了更高的平臺,從多肽、核酸、純化蛋白質(zhì)等基因水平探討一種疾病的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)提上日程。如何尋找具有高靈敏度和高特異性的蛋白質(zhì)是原發(fā)性小肝癌早期診斷的關(guān)鍵所在,采用基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜 (MOLDI-TOF-MS)技術(shù)對原發(fā)性小肝癌患者與正常人血清蛋白質(zhì)譜進行分析,得到高敏感性和特異性的血清蛋白,且能將小肝癌與正常人較準確的分開,建立診斷模型指紋圖譜,為小肝癌的臨床診斷及治療提供積極因素。

        本研究利用MOLDI-TOF-MS技術(shù)和Flex Analysis和BioTools分析軟件,對35例原發(fā)性小肝癌血清標本與50名正常人血清樣本進行對比,結(jié)果顯示:在0~100000 Da質(zhì)荷比范圍內(nèi),小肝癌組與正常人組有顯著性差異的蛋白質(zhì)峰為55個 (P<0.05),兩組有非常顯著性差異的蛋白質(zhì)峰為30個(P<0.01);通過交叉驗證,結(jié)果以M/Z值為7771.17 Da的蛋白質(zhì),具有較高敏感性和特異性,可將正常人及小肝癌患者準確分開,且M/Z值為7771.17Da蛋白質(zhì)在小肝癌組中低表達,在正常人組中高表達。再以M/Z值為7771.17 Da蛋白質(zhì)作為生物標記,隨機抽取小肝癌與正常人血清標本進行雙盲驗證,結(jié)果表明此蛋白質(zhì)作為生物標記物可以將肝臟腫瘤與非腫瘤準確地分組,其敏感性為91.0%,特異性為70.0%。

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