哈?！ぐ涂耍瑥堄篮?，郭 將，李傳民，馬 倩，趙衍銅，邱崢艷，張嘉保，趙志輝*

(1.吉林大學 畜牧獸醫(yī)學院，吉林 長春 130062;2.吉林大學 實驗動物中心，吉林 長春 130062)

AMPK(adenosine monophosphate activated protein kinase)是一種能被腺苷一磷酸(AMP)激活的蛋白激酶，在動物應激時通過改變機體內(nèi)脂類和糖代謝起著重要作用。AMPK是一個異三聚體酶復合體，包含一個催化α亞基，以及調(diào)控的β和γ亞基。7個不同的亞型(α1，α2，β1，β2，γ1，γ2 和γ3)由不同的基因編碼。部分研究表明，在AMPK亞基基因中自然出現(xiàn)的突變能引起顯著的表型效應。PRKAG3基因是編碼一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)調(diào)節(jié)亞基 γ3的基因，包含13個外顯子和12個內(nèi)含子，主要在骨骼肌中 表 達[1，2]， 與 糖 代 謝 有 關(guān)， 通 過 調(diào) 節(jié)AMPK的活性來調(diào)節(jié)機體的能量平衡，通過磷酸化作用抑制糖原合成酶活性，降低糖原的合成速率，促進肌肉對葡萄糖的吸收能力，從而提高骨骼肌中肌糖原含量，進而對肉質(zhì)品質(zhì)產(chǎn)生影響[3～5]，是近年來確定的一個影響豬肉質(zhì)pH值、肉色以及系水力的主效基因。

目前，國內(nèi)外對蘆花雞PRKAG3基因的相關(guān)研究報道比較少，因此研究其肉質(zhì)性狀與遺傳標記之間的關(guān)系將具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本研究以蘆花雞為研究對象，以PRKAG3基因作為候選基因，采用PCRSSCP的方法分析PRKAG3基因外顯子11多態(tài)性，并與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性進行分析，旨在進一步認識蘆花雞種質(zhì)特性，以期對蘆花雞的選種、早期選育、雜種優(yōu)勢的利用等提供基礎(chǔ)參數(shù)，為蘆花雞改良育種和新品系的培育提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗屠宰的蘆花雞均來自吉林省農(nóng)業(yè)科學院，飼養(yǎng)環(huán)境和條件相同，從而避免了牧場效應和環(huán)境因素對試驗結(jié)果的影響。87只蘆花雞頸靜脈放血處死后取其胸肌組織，一側(cè)胸肌用于基因組DNA的提取，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?，另一?cè)胸肌用于肉質(zhì)性狀的測定。

1.2 常規(guī)肌肉品質(zhì)測定

pH值:在屠宰后45 min內(nèi)用pH-start普通版酸度計測定。

肉色:使用OPTO-start普通版測定。

剪切力:將胸肌放入75℃的水浴鍋中，水浴加熱至中心溫度達到70℃，保持5 min取出，冷卻至室溫，用直徑為1.27 cm的空心取樣器沿肌纖維方向鉆取3個肉柱，然后用C-LM3型嫩度計進行測定，求其平均值。

滴水損失:將修整好的樣品稱重(W0)，懸吊于冰箱冷藏層，保存24 h，取出肉樣，用潔凈濾紙輕輕拭去肉樣表層汁液后稱重(W1)，按該公式計算滴水損失:滴水損失= [(W0-W1)/W0] ×100%。

1.3 引物設計

根據(jù)PRKAG3基因的序列(GeneBank登錄號為:DQ280152)，利用軟件Premier 5.0設計引物，擴增片段長度為303 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，上游引物:5'-CCCTCCTCTGTCTCCTTACA-3'，下游引物:5'-AAGGGATGCGCTCCTACCGC-3'。

1.4 目的片段PCR擴增

50 μL 反應體系:基因組 DNA2.0 μL(約50 ng)，上游引物(10 pmol·μL-1)1.0 μL，下游引物 (10 pmol· μL-1)1.0 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4.0 μL，10 ×PCR Buffer5.0 μL，ExTaq DNA 聚合酶(1U·μL-1)0.5 μL，滅菌水 36.5 μL。擴增條件為:94℃預變性4 min，94℃變性30 s，63℃退火45 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR產(chǎn)物的SSCP分析

2 μL PCR 產(chǎn)物與5 μL 變性 Buffer混勻，98℃變性10 min，迅速冰浴5 min，用微量注射器將變性樣品點于11%PAGE中，150 V電泳14 h;取下凝膠，置于70%乙醇中，輕搖10～15 min，雙蒸水洗膠3次，將凝膠置于染色液中，輕搖約30 min，去染色液，雙蒸水洗膠3次，顯色液顯色至條帶清晰出現(xiàn)，用雙蒸水沖洗以終止反應。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究所用蘆花雞的年齡、性別以及飼料等試驗條件一致，數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計，差異顯著用ONE-WAY ANOVA方差分析，進行Duncan's LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，可看到一條大小為303 bp的片段，目的片段明亮、特異性好，可進行SSCP分析。

圖1 PRKAG3基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 PCR-SSCP檢測結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果出現(xiàn)3種基因型:TT、TG和GG(如圖2)。由圖2中可以推斷出，該位點由1對等位基因控制(分別命名為等位基因T和G)。

圖2 PRKAG3基因PCR-SSCP凝膠電泳圖

2.3 測序結(jié)果

將測序結(jié)果與GeneBank上序列(登錄號:DQ280152)進行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TT型的序列與GeneBank中的序列相同，定義為野生型，GG型第2832位的T突變?yōu)镚，定義為突變型。兩個純合基因型的測序結(jié)果見圖3。

圖3 TT和GG基因型的測序峰圖

2.4 基因頻率與基因型頻率

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘆花雞PRKAG3基因TG基因型的頻率最高，其次是TT型和GG型(如表1)。等位基因T和G的頻率分別為0.747和0.253，等位基因T在群體中占優(yōu)勢。適合性X2檢驗結(jié)果表明，蘆花雞(X2=0.1412，P＞0.05)群體 PRKAG3基因第11外顯子處于Hardy-Weiberg遺傳平衡狀態(tài)。

表1 蘆花雞PRKAG3基因的基因型和等位基因頻率

2.5 PRKAG3不同基因型與蘆花雞肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析

將PRKAG3基因多態(tài)位點與蘆花雞肉質(zhì)性狀進行最小二乘分析，結(jié)果顯示PRKAG3不同基因型對pH值有顯著影響，如表2所示。pH值為GG型極顯著低于TG型和TT型(P＜0.01)，而TG型顯著低于TT型(P＜0.05);其它肉質(zhì)性狀在不同基因型間差異不顯著。

表2 蘆花雞PRKAG3基因不同基因型的肉質(zhì)性狀的最小二乘分析

3 討論與結(jié)論

在生命科學的研究領(lǐng)域里，對動物生長發(fā)育的研究是一個永恒的課題，揭示動物生長發(fā)育規(guī)律和實現(xiàn)對動物生長發(fā)育的調(diào)控一直是人類美好的愿望。肉質(zhì)性狀一直是消費者和生產(chǎn)者共同關(guān)心的問題，是近年遺傳育種學家研究的熱點和難點。隨著育種學及分子生物學的飛速發(fā)展，動物育種工作已取得了前所未有的進步。

肉質(zhì)性狀包括胴體組成和肌肉品質(zhì)兩大部分，為典型的數(shù)量性狀，其遺傳力大都在0.15～0.30之間，其中有關(guān)胴體組成的部分肉質(zhì)性狀具有較高的遺傳力，有的可高達0.50左右。大量研究表明，PRKAG3基因可作為一個影響肉質(zhì)性狀的候選基因，存在較高的變異頻率。Matthieu在總長8 048 bp的cds上共發(fā)現(xiàn)32個SNPs位點，平均每250 bp就存在1個SNP，有5個突變使氨基酸發(fā)生 了 改 變[6]。 李 靜 等[7]對 延 邊 黃 牛 的PRKAG3基因的多態(tài)性進行了分析，發(fā)現(xiàn)PRKAG3基因第10外顯子存在C4738T突變，且不同基因型所對應的嫩度、肉色(24h紅色度與黃色度)、油酸、亞麻酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、纈氨酸和脯氨酸存在一定的相關(guān)性。李武峰等[8]對7個品種牛的PRKAG3基因的多態(tài)性進行了分析，發(fā)現(xiàn) PRKAG3基因第4內(nèi)含子存在T2643C和T2885C兩處突變，且不同基因型所對應的嫩度性狀存在顯著差異。在PRKAG3基因中發(fā)現(xiàn)的一個單堿基突變(R200Q)解釋了RN-性狀的顯性變異，這個R200Q突變導致RN-/RN-和RN-/rn+動物的肌肉糖原含量提高了70%，豬被屠宰之后24h測定肌肉的pH值較低，肌肉系水力下降，烤制火腿的產(chǎn)量也降低。這個R200Q等位位點與所有RN-型動物有關(guān)，并在漢普夏品種中有很高的比例，但不存在于 rn+ 基因型或其它品種豬中[9，10]。而I199V對幾乎所有研究的性狀都有極顯著的效應，不僅包括糖原、乳酸、糖酵解潛能這些指標，還有一些與之相關(guān)的其他肉質(zhì)性狀[11]。發(fā)生在豬γ3亞基V224I的變異，進一步證明了γ3亞基變異對骨骼肌糖原內(nèi)含物和全部的肌肉生化內(nèi)含物的作用，它與在糖原內(nèi)含物以及乳酸內(nèi)含物和糖酵解潛能的減少相關(guān)[12]。

近年來，經(jīng)濟性狀功能基因的多態(tài)性研究，已成為動物遺傳育種研究的熱點之一。標記輔助選擇(MAS)是目前研究最多的方法，它是將現(xiàn)代分子生物學技術(shù)與常規(guī)育種方法相結(jié)合，借助分子標記選擇某一位點基因改變該位點基因頻率的過程，也稱分子輔助選擇。當前，國內(nèi)外對PRKAG3基因的研究主要集中在它與豬的肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析上，而對雞的肉質(zhì)性狀的研究相對較少。本研究采用PCR-SSCP檢測了蘆花雞PRKAG3基因的外顯子11的遺傳多態(tài)性，結(jié)果顯示PRKAG3不同基因型對pH值有顯著影響，其它肉質(zhì)性狀在不同基因型間差異不顯著。由此證明，PRKAG3基因有可能成為對蘆花雞肉質(zhì)性狀產(chǎn)生影響的候選基因，可作為選育蘆花雞肉質(zhì)性狀的分子標記，用于標記輔助選擇意義重大。

[1] Cheung P C， SaltI P， Davies S P， etal.Characterization of AMP- activated protein kinase gamma-subunit isoforms and their role in AMP binding[J].J Biochem，2000，346:659-669.

[2] YU S L，J E Kim，H J Chung，et al.Molecular cloning and characterization of bovine PRKAG3 gene:structure，expression and single ntcleotide polymorphism detection [J].Anim Breed Gent，2005，122:249-301.

[3] 李夢云，陳代文，張克英.PRKAG3在豬組織器官中的表達差異及與胴體品質(zhì)關(guān)系研究 [J].畜牧獸醫(yī)學報，2006，37(6):566-570.

[4] Ferre P， Azzoutmarniche D， Foufelle F. AMP activated protein kinase and hepatic genes in volved in glucose metabolism [J].Biochem Soc Trans，2003，31:220-223.

[5] Winder W W，Holmes B F，Rubink D S，et al.Activation of Amp-actived protein kinase increases mitoehondrial enzymes in skeletal muscle [J].J Appl Physiol，2000，88:2219-2226.

[6] Matthieu R，Angelique N，Lionel F，et al.Transcripts and polymorphisms of the bovine PRKAG3 gene [J].Msmmalian Genome，2006，17:83-92.

[7] 李靜，曹陽，張立春，等.延邊黃牛PRKAG3基因第10外顯子單核苷酸多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析 [J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(3):123-126.

[8] 李武峰，楊潤軍，甘乾福，等.肉牛PRKAG3基因多態(tài)性及其與胴體和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析 [J].畜牧獸醫(yī)學報，2009，40(7):1106-1111.

[9] Milan D，Jeon J T，Looft C，et al.A mutation in PRKAG3 associated with excess g!ycogen content in pig skeletal musele [J].Seience，2000，288(5469):1248-1251

[10] 徐寧迎，趙興波，蔣思文.豬雞肉質(zhì)性狀分子標記及主效基因的研究進展 [J].中國畜牧雜志，2004，40(4):42-44.

[11] Ciobanu D，Bastiaansen J，Malek M，etal.Evidence for new alleles in the protein kinase adenosine monoPHosPHate-aetivatedgamma(3)-subunit gene assoeiated with low glyeogen ceontent in Pig skeletal musele and improved meat quality [J].Geneties，2001，159(3):1151-1162.

[12] Ciobanu D， Bastiaansen J， Malek M， et al.Evidence for new alleles in the protein kinase adenosine monophosphate-activated gamma(3)-subunit gene associated with low glycogen content in pig skeletal muscle and improved meat quality [J].Genetics，2001，159:1151-1162.