郭夢媛 皇甫輝 王丹丹 韓 瑞 李 卓 趙 軼

山西醫(yī)科大學第一臨床附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，山西太原 030000

喉鱗狀細胞癌是呼吸道最常見的惡性腫瘤之一，大量研究顯示趨化生長因子受體4（CXCR4）在某些腫瘤組織中有著過量的表達，通過SDF-1/CXCR反應軸控制腫瘤細胞遷徙和靶器官特異性表達[1-2]。而基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）在趨化因子生物軸的下游激活途徑中有其結(jié)合位點，從而促進磷酸化，使作用增強[3]。本文研究采用免疫組織化學方法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測CXCR4和MMP-13的蛋白及mRNA在喉鱗狀細胞癌及其正常黏膜組織中的表達情況，探討CXCR4和MMP-13在喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

免疫組化方法選擇我院耳鼻喉科2009年10月～2011年9月喉鱗癌切除后存檔的蠟塊，共70例，患者年齡為34～76歲，平均（56.7±6.7）歲，其中男 60 例，女 10 例；RT-PCR 方法選擇2010年7月～2011年9月喉鱗癌切除后的新鮮組織，共 30 例，患者年齡為 36～72 歲，平均（55.9±6.2）歲，其中男25例，女5例。以上臨床資料均完整，患者術(shù)前未接受放化療。收集10例癌旁正常喉黏膜的新鮮組織做為對照組，一部分石蠟包埋用于免疫組化，另一部分置于滅菌的錫箔紙內(nèi)，投入液氮罐內(nèi)，隨后放入深低溫（-86℃）冰箱中保存，用于RT-PCR技術(shù)實驗用。

1.2 免疫組織化學方法

CXCR4和MMP-13均以兔抗人多克隆抗體（武漢博士德生物技術(shù)有限責任公司）。實驗嚴格按照試劑盒說明書操作。結(jié)果均由兩位病理主治醫(yī)師共同閱片得出。CXCR4和MMP-13蛋白均以細胞漿呈有棕黃色顆粒為陽性，每張切片觀察5個具有代表性的高倍鏡視野，根據(jù)染色部位的染色強度和染色細胞百分率進行評分：基本不著色為0分，著色淡者為1分，著色深者為2分；著色細胞占計數(shù)細胞百分率＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。將每張切片的著色強度得分和著色細胞百分率得分相乘，為其最后得分。0～1分為陰性（-），≥2分為陽性。

1.3 RT-PCR方法

采用Trizol試劑提取總RNA，引物設計應用primer 5.0軟件，序列及合成的產(chǎn)物大小為：CXCR4上游：5′-CGGAA TTCCAGCAGGTAGCAAAGTGACG-3′，下游：5′-GACGCCAAC ATAGACCACCT-3′；擴增長度為 561 bp；MMP-13 上游：5′-GACTTCACGATGGCATTGCTG-3′，下游：5′-GCATCAACCTGCTGAGGATGC-3′；擴增長度為491 bp；以GAPDH為內(nèi)參對照。 反應體系均為 94℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃90 s 35個循環(huán)，72℃5 min；產(chǎn)物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，照相并分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SAS 6.12進行數(shù)據(jù)的分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗，并進行線性相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

2.1.1 CXCR4及MMP-13在喉鱗癌與正常黏膜中的表達 由表1可見，CXCR4及MMP-13在喉鱗癌中表達的陽性率明顯高于正常黏膜組織。CXCR4和MMP-13在喉鱗狀細胞癌中表達于腫瘤細胞的細胞質(zhì)及細胞膜，呈陽性或強陽性，而在正常喉黏膜上皮細胞中呈弱陽性或陰性，見圖1～4。

圖1 CXCR4在正常組織中的表達（免疫組化，×200）

圖2 CXCR4在癌組織中表達（免疫組化，×200）

2.1.2 喉鱗癌中CXCR4及MMP-13在不同臨床病理特征的表達 由表2可見，喉鱗癌CXCR4蛋白的表達與腫瘤的分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，喉鱗癌MMP-13蛋白的表達與腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），CXCR4及MMP-13均與年齡和性別無關(guān)。

圖3 MMP-13在正常組織中的表達（免疫組化，×200）

圖4 MMP-13在癌組織中表達（免疫組化，×200）

2.1.3 喉鱗癌中CXCR4及MMP-13蛋白表達的相關(guān)性分析 對喉鱗癌中CXCR4及MMP-13蛋白的表達進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)（r=0.45，P＝0.012 5）。

2.2 RT-PCR結(jié)果

2.2.1 CXCR4與MMP-13在喉鱗癌組與正常黏膜組中mRNA的表達 CXCR4 為（1.25±0.28）、（0.55±0.19），鱗癌組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；喉鱗癌組與正常黏膜組中MMP-13 mRNA 的表達分別為（1.10±0.21）、（0.04±0.01），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CXCR4及MMP-13在喉鱗癌和正常黏膜中mRNA表達情況經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增條帶結(jié)果，見圖 5～6。

2.2.2 喉鱗癌中CXCR4和MMP-13 mRNA在不同臨床病理特征中的表達 喉鱗癌CXCR4和MMP-13 mRNA的表達量與腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表3 喉鱗癌中趨化生長因子受體4及基質(zhì)金屬蛋白酶-13 mRNA在不同臨床病理特征的表達（±s）

表3 喉鱗癌中趨化生長因子受體4及基質(zhì)金屬蛋白酶-13 mRNA在不同臨床病理特征的表達（±s）

臨床病理特征 例數(shù) CXCR4 t值 P值 MMP-13 t值 P值分化程度高、中分化低分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13 17 0.99±0.26 1.45±0.25 6.570.026 30.85±0.21 1.29±0.20 6.020.028 4無有16 14 1.09±0.24 1.43±0.22 5.760.034 20.94±0.23 1.28±0.19 5.780.034 0

2.2.3 喉鱗癌中CXCR4及MMP-13 mRNA表達的關(guān)系 經(jīng)線性相關(guān)分析，喉鱗癌中CXCR4及MMP-13 mRNA的表達呈正相關(guān)（r=0.42，P ＝ 0.027 5）。

3 討論

腫瘤的生長與擴散是重要的生物學行為，而蔓延與遠處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤細胞和細胞外基質(zhì)成分共同參與的一個復雜而有序的過程，細胞外基質(zhì)的降解及腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移是必不可少的過程。CXCR4是一類表達于不同細胞上含有7個跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體，SDF-1是CXCR4的唯一配體，研究顯示某些腫瘤組織CXCR4有著過量的表達，控制白細胞對腫瘤的浸潤，調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，激活宿主對腫瘤細胞的特異性免疫應答，以自分泌或旁分泌的方式刺激腫瘤細胞的增殖，通過SDF-1/CXCR4反應軸控制腫瘤細胞遷徙和靶器官特異性表達[4]。SDF-1/CXCR4生物學軸的活動表現(xiàn)為細胞內(nèi)儲備鈣的調(diào)動及MAPK（絲裂原結(jié)合蛋白酶）的活化，伴其下游信號分子的磷酸化[5]。腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多基因調(diào)控的復雜過程，癌細胞從原發(fā)病灶脫落后，需突破細胞外基質(zhì)和基底膜組成的結(jié)構(gòu)屏障，才能向周圍組織侵襲或進入脈管中，引發(fā)轉(zhuǎn)移[6-7]，在此過程中，起作用的有基質(zhì)金屬蛋白酶家族。CXCR4在腫瘤發(fā)展過程中可以引起MMPs的磷酸化，使腫瘤細胞分泌更多的MMPs。MMP-13是基質(zhì)金屬蛋白酶家庭的重要成員，是1994年首先從人類乳腺癌細胞中分離出來的，在MMPs激活過程中起關(guān)鍵作用，可激活其他亞型的MMPs，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用[8-9]。如MMP-13在激活其他MMP的過程中還具有催化自身的作用，可促進活性MMP-9的產(chǎn)生，在此過程中MMP-13處于中心地位[10]，MMP-13水平的微小改變或活性的增強，都可能放大整個下游的蛋白分解作用，從而降解細胞外基質(zhì)和基底膜對組織產(chǎn)生破壞。

表1 趨化生長因子受體4及基質(zhì)金屬蛋白酶-13在喉鱗癌與正常喉黏膜中的表達[n（%）]

表2 趨化生長因子受體4及基質(zhì)金屬蛋白酶-13的表達與喉鱗癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

圖5 CXCR4基因在不同喉組別中的表達

圖6 MMP-13基因在不同喉組別中的表達

本實驗通過采用免疫組織化學方法和RT-PCR方法檢測喉鱗癌組織及癌旁正常黏膜組織中CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA的表達，免疫組織化學檢測結(jié)果顯示CXCR4及MMP-13在喉鱗癌組織中的蛋白表達率分別為71.43%和74.29%，明顯高于正常黏膜組（P＜0.01）。結(jié)果還表明，CXCR4蛋白表達水平與腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，MMP-13蛋白表達水平與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與腫瘤分期無關(guān)，本研究結(jié)果的出現(xiàn)可能與病例選擇或例數(shù)較少有關(guān)。二者蛋白表達均與腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、性別無關(guān)，提示CXCR4和MMP-13可能在喉癌的形成和發(fā)展過程中有一定的作用，與喉癌淋巴結(jié)的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。并通過Rt-PCR結(jié)果顯示，CXCR4和MMP-13在喉癌組織中mRNA表達明顯高于癌旁正常黏膜（P＜0.05），在分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中表達水平有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這一結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致，由于分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均與患者的預后相關(guān)，因此CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA可能有助于判斷患者的預后，即CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA高表達患者的預后差，進而通過檢測兩者的表達來預測喉癌的早期轉(zhuǎn)移和復發(fā)。

本研究還通過對CXCR4和MMP-13蛋白的表達進行相關(guān)性分析，二者呈正相關(guān)（r=0.45，P=0.012 5），同時，CXCR4和MMP-13 mRNA表達的相關(guān)分析與蛋白表達相同（r=0.42，P=0.027 5）。說明在喉鱗癌中CXCR4及MMP-13在蛋白和mRNA水平上都具有協(xié)同正向作用，提示二者在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展中具有明顯的促進作用。

綜上所述，喉鱗癌組織中CXCR4和MMP-13在蛋白水平及mRNA水平均升高，二者共同促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可通過術(shù)后聯(lián)合檢測CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA的表達來評估喉癌的浸潤轉(zhuǎn)移、術(shù)后復發(fā)等，有可能對判斷預后有一定價值。

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