張學林 余秉翔

1.解放軍總醫(yī)院呼吸科，北京 100853；2.解放軍總醫(yī)院國際醫(yī)學中心，北京 100853

siRNA（small interfering RNA）是一種雙鏈小 RNA分子（長 21～25 bp），是 RNA 干涉（RNAi）途徑中的中間產(chǎn)物，是RNAi發(fā)揮效應所必需的因子，它通過與一系列特異性蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合物（RISC），激發(fā)與之互補的目標mRNA的降解。siRNA對靶序列的作用具有高效性，在細胞內(nèi)，siRNA能在低于反義核苷酸幾個數(shù)量級的濃度下，使靶基因表達水平降低[1]。肺癌是目前全世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤[2]，按組織學分為小細胞肺癌（small-cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC占80%以上，我國肺癌五年生存率僅為8%～10%，65%的肺癌患者在診斷明確時已發(fā)展至晚期，失去手術機會[3]。化療在肺癌治療中具有極為重要的作用，鉑類藥物聯(lián)合其他化療藥物目前仍是治療NSCLC的主要方案。據(jù)統(tǒng)計，在我國以順鉑為主或含有順鉑聯(lián)合用藥的化療方案占所有抗腫瘤化療方案的70%～80%[4]。但是其嚴重的腎毒性、耳毒性及消化道損傷等藥物蓄積性毒副反應制約著該藥的臨床應用[5]。為減少鉑類藥物的副作用，到目前已研發(fā)了許多鉑類藥物，但至今仍未找到一種滿意的產(chǎn)品。為解決這一問題，本研究期望通過提高腫瘤對化療藥物的敏感性，在相同療效甚至提高療效的前提下減少化療藥物的用量，從而將毒副反應控制在較低水平。有研究表明，Bcl-2基因能抑制諸如抗腫瘤藥等凋亡信號引起的細胞凋亡[6]。該基因的高表達與人肺腺癌細胞順鉑耐藥關系密切[7]。本研究擬以人肺腺癌細胞A549為模型，通過siRNA技術降低腫瘤細胞中Bcl-2基因的表達，進而增加A549細胞對順鉑的敏感性，為減少順鉑劑量限制性毒副反應提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肺腺癌細胞株A549（ATCC）購于中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所，用含10%的胎牛血清（Hyclone）的RPMI-1640培養(yǎng)液加100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，于37℃、5%CO2的孵箱中孵育。

1.2 試劑與儀器

注射用順鉑（凍干型）為齊魯制藥產(chǎn)品；jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑購于 PolyPlus-transfection 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自DOJINDO公司；TRI Reagent購自Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司；熒光PCR試劑購于TaKaRa公司；Bcl-2、GAPDH抗體購于Santa Cruz公司。siRNA由上海吉瑪公司合成（Negative Control RNA序列為 ：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3'，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。 Bcl2-siRNA 序 列[8]為 ：5'-UGUGGAUGACUGAGUACCUGAdTdT-3'，5'-UCAGGUACUCAGUCAUCCACAdTdT-3'）；其余試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。Mx3000p熒光實時定量PCR儀由Stratagene生產(chǎn)；MS酶標儀由芬蘭Labsystems生產(chǎn)。

1.3 轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，每孔1.0×105個細胞，接種16 h后采用jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑，按說明書進行轉(zhuǎn)染。每孔轉(zhuǎn)染雙鏈RNA終濃度為20 nM。轉(zhuǎn)染24 h后換為正常培養(yǎng)液。實驗分為陰性對照組（轉(zhuǎn)染Negative Control RNA）和試驗組（轉(zhuǎn)染Bcl2-RNA）。

1.4 Real time RT-PCR

總RNA的提取采用TRI Reagent法，按照說明書進行。RNA提取后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按說明書操作。以GAPDH為內(nèi)參照擴增Bcl2基因。GAPDH上游引物：5'-TCAGTGGTG GACCTGACCTG-3'， 下游 引物 ：5'-TGCTGTAGCCAAATTCG TTG-3'。Bcl-2 上游引物：5'-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3'，下游引物：5'-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT-3'。 用 2-ΔΔCt方法處理實時定量數(shù)據(jù)，計算Bcl-2 mRNA的表達差異。實驗重復3次，取平均值。

1.5 CCK-8 assay

細胞轉(zhuǎn)染32 h后，接種于96孔板，每孔2.0×103個細胞，接種16 h后換為新鮮配置的含不同濃度順鉑的培養(yǎng)液（0、0.5、1、2、3 μg/mL）， 每個濃度 5 個復孔。 藥物作用 48 h后，換為新鮮配置的含10%CCK-8液的培養(yǎng)液100 μL，置孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，1 h后用多功能酶標儀于450 nm波長下檢測每孔吸光度值（A）。按公式計算每個濃度的順鉑對細胞生長的抑制率（IR）：IR（%）＝（1-Ai/A0）×100%（注：Ai為各濃度順鉑組的平均吸光值，A0為不加順鉑組的平均吸光值），并計算順鉑對陰性對照組和實驗組中A549細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。實驗重復3次，取平均值。

1.6 Western Blot analysis

用RIPA裂解液收集轉(zhuǎn)染后細胞，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，利用10%的SDS-PAGE膠進行分離等量蛋白，然后轉(zhuǎn)膜、封閉，加入1∶1 000稀釋的兔抗人Bcl-2單克隆抗體，以及1∶5 000稀釋的二抗。最后加入發(fā)光試劑，曝光、顯影。以GAPDH為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組獨立樣本采用t檢驗，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-2 mRNA及蛋白在A549細胞中轉(zhuǎn)染siBcl-2后的差異表達

在A549細胞中轉(zhuǎn)染雙鏈RNA 48 h后，實驗組同陰性對照組相比，Bcl-2 mRNA表達水平降低了 93.2%（P=0.037）（圖1），其蛋白表達也明顯降低（圖2），幾乎達到“敲出”該基因的效果。

2.2 A549細胞轉(zhuǎn)染siBcl-2后對順鉑的敏感性增強

根據(jù)CCK-8結(jié)果顯示，順鉑對兩組A549細胞的增殖均有抑制作用（圖3）。轉(zhuǎn)染Negative Control后順鉑對A549細胞的 IC50值為（2.68±0.37）μg/mL，轉(zhuǎn)染 Bcl2-siRNA 后的 IC50值為（0.81±0.24）μg/mL，轉(zhuǎn)染 Bcl2-siRNA 后 A549 細胞對順鉑的敏感性提高了 69.8%（P=0.024）（圖4）。

3 討論

順鉑是一種經(jīng)典的腫瘤化療藥物，該藥療效具有劑量依賴性，但是隨著給藥量的增加，其對機體的毒副作用也相應增加，這就使得順鉑的使用具有一定的限制性[9]。順鉑的毒副作用包括骨髓、腎、耳、胃腸道毒性及過敏反應等[10-14]。在臨床應用中，嚴重的腎毒性是限制治療的常見因素[10]，其腎毒性具有劑量限制性，主要損傷近曲小管，較少累及遠曲小管和腎小球[11]，可以引起腎小管的萎縮及腎臟纖維化[10]。其耳毒性表現(xiàn)為順鉑治療過程中可出現(xiàn)累及性、不可逆的聽力受損[12-13]，順鉑導致的過敏反應，隨著用藥療程和劑量的增加而隨之增加，嚴重者甚至可出現(xiàn)生命危險[14]。探索一種能提高腫瘤對化療藥物順鉑敏感性的方法顯得至關重要。

本研究以人肺腺癌細胞A549為模型，將Bcl2-siRNA轉(zhuǎn)染進入細胞，使得A549細胞中Bcl-2 mRNA表達水平降低了93.2%，而且Bcl-2蛋白表達量也明顯降低。本研究進一步通過CCK-8法測得細胞在轉(zhuǎn)染Bcl2-siRNA后，對順鉑的敏感性提高了 69.8%，IC50值由（2.68±0.37）μg/mL 下降至（0.81±0.24）μg/mL。據(jù)此，可以相信將此方法應用于臨床，將極大地降低順鉑的治療劑量，從而能夠?qū)㈨樸K的毒副反應控制在較低水平。

Bcl-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，B 細胞淋巴瘤/白血病）基因，是1984年從B細胞濾泡性淋巴瘤中分離出來的一種原癌基因。該基因定位于染色體18q1.3上，大小約230 kb，編碼26×103 kDa大小的蛋白。Bcl-2基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用[15]。其表達水平與多種腫瘤對化療藥物敏感性有關[16]。Bcl-2蛋白過度表達時，可以抑制活性氧對細胞誘發(fā)的凋亡，也可以拮抗細胞內(nèi)因還原型谷胱甘肽含量的下降所誘發(fā)的凋亡[17]，同時它還能影響細胞內(nèi)鈣內(nèi)流而抑制凋亡[18]。Bcl-2基因低表達的卵巢癌對化療反應良好[19]。人肺腺癌細胞對紫杉醇的敏感性也與Bcl-2基因的表達有關[20]。

本實驗將siRNA同順鉑結(jié)合起來，極大程度提高了A549細胞對順鉑的敏感性。這一方面應證了Bcl-2基因與人肺腺癌細胞對順鉑敏感性具有密切的關系，另一方面也為臨床治療中如何減輕順鉑毒副作用的程度，或者減少順鉑毒副作用的發(fā)生提供了一種新的思路及理論依據(jù)。

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