林建安，葉建新，楊樹鋼

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，福建福州350005)

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是cerb-B1基因編碼的Src族跨膜受體，酪氨酸激酶是細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)的重要樞紐［1－2］，在腫瘤發(fā)展過程中起重要作用，是治療腫瘤的理想靶點(diǎn)，其靶向藥物西妥昔單抗已經(jīng)應(yīng)用于臨床且取得了良好的效果，但目前處于平臺(tái)期;RNA干擾技術(shù)是將與信使RNA(mRNA)對(duì)應(yīng)的外源性小片段RNA導(dǎo)入細(xì)胞，與該片段siRNA同源的mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因受到抑制的技術(shù)，在剔除目標(biāo)基因上具有特異性、穩(wěn)定性及高效性等優(yōu)勢(shì)，正成為包括結(jié)腸癌在內(nèi)各種腫瘤基因治療研究中的熱點(diǎn)［3］。本研究利用siRNA方法抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞EGFR基因的表達(dá)，并觀察受抑制后人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞體外生長(zhǎng)情況的改變。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，RPMI-1640培養(yǎng)基和小牛血清購(gòu)自GIBCO公司，EGFR抗體購(gòu)自Santa公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000和青霉素－鏈霉素液體購(gòu)自Invitrogen公司，MTT購(gòu)自Sigama公司，熒光定量RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。EGFR-siRNA由上海吉瑪制藥有限公司合成。EGFR-siRNA干擾序列見表1。

表1 EGFR-siRNA干擾序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞。細(xì)胞傳代時(shí)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1∶2或1∶3傳代，加入培養(yǎng)液后在37℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天收集3～5×105細(xì)胞接種在6孔板上，2 mL含 小牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，將稀釋好的siRNA和RNAi-Mate試劑混合;輕柔混勻，室溫放置 20 min，以便形成 siRNA/lipofectamin復(fù)合物。將6孔板中的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2遍后，加入2 mL無血清培養(yǎng)基，將500 μL siRNA/lipofectamin復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，來回輕搖細(xì)胞培養(yǎng)板，孵育4～6 h后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基，細(xì)胞繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24～48 h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其他檢測(cè)步驟。

1.2.3 熒光定量 RT-PCR TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增EGFR基因，上游引物 5'-GAGTTAAGATTTTTTTAAGGGTCCC-3'，下游引物 5'-TAACTGACATGGGTCGGCC-3'，內(nèi)參基因 β actin，上游引物5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，反應(yīng)體系為 SYBR?Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L－1)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L－1)0.4 μL，ROX Reference Dye(50 ×)0.4 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O(滅菌蒸餾水)6.8 μL，Total 20 μL;反應(yīng)條件為95℃、30 s然后 95 ℃、5 s，57 ℃、30 s。本實(shí)驗(yàn)采用ABI step one PCR儀(美國(guó)生物應(yīng)用公司產(chǎn)品)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，RT-PCR結(jié)果根據(jù)靶基因的相對(duì)定量按公式得出，靶基因相對(duì)表達(dá)量 =2－△△Ct。其中△△Ct=(△Ct，Q － △Ct，C)?！鰿t，Q 為實(shí)驗(yàn)組靶基因的Ct值與管家基因Ct值之差;△Ct，C為對(duì)照組靶基因的Ct值與管家基因Ct值之差［4］。

1.2.4 Western blot法 提取待測(cè)細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量，將樣品調(diào)成相同濃度，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，進(jìn)行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜置于封閉液中于4℃封閉過夜以除去非特異的結(jié)合位點(diǎn)，然后一抗孵育，用含1×TBS，洗膜3次，再與二抗孵育，同上洗膜3次。將膜與CDP-Star作為堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光底物，與膜室溫下孵育反應(yīng)5 min后，暗室中X光片曝光、顯影。運(yùn)用圖像分析軟件Qone對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行分析，以蛋白條帶的灰度掃描比值來表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平及統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制率 采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法，待測(cè)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度約為5.0～10×104·mL－1;以每 5.0 ～1.0 ×103個(gè)細(xì)胞接種于4個(gè)96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100 μL。設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，加 200 mL DMSO，放置水平搖床15 min后，在490 nm處測(cè)定吸光度(A)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組－處理組)/(對(duì)照組－本底)×100%

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集;用PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000 r·min－1離心5 min)收集1～5×105細(xì)胞;加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞;加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入 5 μL Propidium Iodide，混勻;室溫、避光、反應(yīng)5～15 min;在1 h內(nèi)，進(jìn)行下述熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)=488 nm;發(fā)射波長(zhǎng)=530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道檢測(cè);PI紅色熒光通過PI通道檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因的表達(dá) 通過引物溶解曲線分析，EGFR基因擴(kuò)增成功，實(shí)驗(yàn)所獲得數(shù)據(jù)采用比較CT值法(2－△△t法)進(jìn)行相對(duì)定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA對(duì)SW480細(xì)胞的mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表 2、圖1。

表2 RT-PCR檢測(cè)各處理組靶基因抑制情況

2.2 EGFR蛋白的表達(dá) EGFR395-siRNA對(duì)EGFR蛋白表達(dá)較對(duì)照組有顯著性抑制作用(P＜0.05)，EGFR395-siRNA對(duì)EGFR的表達(dá)較對(duì)照組抑制比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞中的EGFR蛋白在EGFR-395和 EGFR1499-siRNA組的表達(dá)下調(diào)，EGFR-1211 siRNA和脂質(zhì)體組、NC組、對(duì)照組的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.3 細(xì)胞增殖抑制率 不同處理之后，EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA作用于SW480細(xì)胞48 h后與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但由于時(shí)間延長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)為瞬轉(zhuǎn)，siRNA脫靶效應(yīng)，抑制率逐漸下降。見圖3。

2.4 EGFR-siRNA作用后細(xì)胞凋亡率 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡率分別為對(duì)照組(3.2±0.7)%，EGFR395-siRNA 組(15.8 ±1.2)%，EGFR1211 組(9.5 ±2.1)%，EGFR1499-siRNA 組(14.1 ± 1.7)%;EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA組較對(duì)照組凋亡率均高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＜0.05)。見圖4。

3 討論

EGFR在很多腫瘤組織中過表達(dá)。有研究［5］表明70%以上的結(jié)腸癌組織中有EGFR高水平表達(dá)，EGFR高表達(dá)或活性增強(qiáng)與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、抗凋亡及放化療敏感度下降等許多特性有關(guān)，因此研究 EGFR及針對(duì)EGFR的治療，成為近年來抗腫瘤治療的熱點(diǎn)。

RNA干擾是近年發(fā)展起來的沉默基因的新技術(shù)，其是指由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，通過具有序列特異性的雙鏈RNA或shRNA與靶基因mRNA結(jié)合而導(dǎo)致目的基因表達(dá)下調(diào)，RNA干擾具有高穩(wěn)定性，高效性，高特異性等特點(diǎn)，目前RNA干擾在癌基因組功能研究和腫瘤基因治療中已顯示出效果。

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來，隨著人民生活水平的不斷提高，飲食習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變以及人口老齡化，我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率均保持上升的趨勢(shì)［6］。EGFR的研究已經(jīng)取得重大突破，其靶向藥物西妥昔單抗已經(jīng)應(yīng)用于臨床且取得良好的效果，但目前處于平臺(tái)期。由于腫瘤基因治療較少涉及倫理問題，加之臨床治療的迫切需要，腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制及其基因治療也已走在基因治療的前列。

本實(shí)驗(yàn)是EGFR與RNA干擾技術(shù)相結(jié)合，探索RNA干擾EGFR的mRNA后對(duì)SW480細(xì)胞的體外干擾情況的研究，通過RT-PCR、Western blot法檢測(cè)到EGFR基因的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯抑制，證實(shí)序列特異性的EGFR-siRNA能顯著抑制EGFR基因的表達(dá)，并通過MTT和流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞增殖與凋亡，表明siRNA可以抑制 SW480細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)SW480細(xì)胞凋亡。本文結(jié)果顯示，以EGFR為靶點(diǎn)的RNA干擾能明顯抑制 SW480細(xì)胞中EGFR基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為結(jié)腸癌的基因沉默療法提供了新的思路，更為以 EGFR基因?yàn)榘谢虻腞NA干擾技術(shù)由基礎(chǔ)到臨床的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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