何運(yùn)元,王 營(yíng),王 黎,趙琳琳,徐學(xué)軍
(1.徐州醫(yī)學(xué)院,江蘇徐州271000;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州450052)
人參皂苷Rg3是從天然紅參中提取的單體,近年來(lái)的研究[1-2]表明人參皂苷Rg3具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管形成的作用,且可在多種腫瘤細(xì)胞株中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲,阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。目前,人參皂苷Rg3對(duì)于腫瘤細(xì)胞作用的分子機(jī)制仍未完全闡明。但研究[3-4]顯示人參皂苷Rg3對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)是其發(fā)揮抗腫瘤功能的重要途徑,其既能促進(jìn)β-catenin參與細(xì)胞黏附作用,又能抑制β-catenin的核內(nèi)轉(zhuǎn)移。而異常激活的Wnt/β-catenin信號(hào)通路造成大量β-catenin在核內(nèi)堆積是許多腫瘤組織突出的分子標(biāo)志之一。β-catenin在細(xì)胞中有2個(gè)去向。β-catenin可與α-catenin和細(xì)胞膜上的E-鈣黏素形成復(fù)合體,并與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白細(xì)絲相連,在細(xì)胞 -細(xì)胞的黏附中發(fā)揮重要作用[5]。游離的β-catenin在沒(méi)有Wnt信號(hào)存在的情況下則進(jìn)入由糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)和干酪素激酶 Iα(casein kinase Iα,CK Iα)參與組成的降解復(fù)合體而被其降解;但如果有Wnt信號(hào)存在,后者將阻斷β-catenin的降解,使之在胞質(zhì)中積聚并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子和淋巴增強(qiáng)因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)結(jié)合而激活下游靶向基因的轉(zhuǎn)錄[6]。其中一些基因的表達(dá)具有已知的促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用,如c-myc、c-jun等。因此當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路過(guò)度激活時(shí)將會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在66%~79%的結(jié)直腸癌組織中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)βcatenin是異常堆積的,而且β-catenin的過(guò)表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度及局部去分化有關(guān)[7-8]。目前,結(jié)直腸癌的化療藥物大多數(shù)是作為DNA、RNA、微管合成干擾的非選擇性的細(xì)胞分裂抑制劑。這些藥物雖然能有效殺死分裂的惡性細(xì)胞,但非選擇性抑制正常細(xì)胞的分裂,尤其是一些分裂旺盛的細(xì)胞,必然引起嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。與此同時(shí),天然小分子藥物以其高選擇性、低毒副反應(yīng)和可能提高惡性腫瘤臨床療效的優(yōu)勢(shì),正成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。而人參皂苷Rg3正是這樣一種針對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的天然小分子物質(zhì),并且我們?cè)诶糜?jì)算機(jī)模擬的針對(duì)β-catenin蛋白的藥物篩選模型中發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg3能與這種蛋白結(jié)合,其存在可影響β-catenin中特定氨基酸位點(diǎn)的修飾,從而發(fā)揮作用?;谝陨涎芯康奶崾荆緦?shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR、Western blot法和流式細(xì)胞儀技術(shù)來(lái)探討人參皂苷Rg3對(duì)腫瘤細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)和磷酸化程度影響,同時(shí)檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和生存的抑制情況,以期為臨床上結(jié)腸癌的診治工作提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480由第二軍醫(yī)大學(xué)海軍研究所饋贈(zèng)。用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng),細(xì)胞環(huán)境為體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱。
1.2 藥品及藥物制備 人參皂苷Rg3購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。藥品用DMSO助溶解,制成原液,-20℃保存。用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM稀釋?zhuān)?藥 物 終 濃 度 達(dá) 到 10、20、40、80、160、320 μmol·L-1。
1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)β-catenin磷酸化水平 收集2×106個(gè)細(xì)胞,質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞40 min,洗滌離心后用1 mL含體積分?jǐn)?shù)0.2%Triton-X100和體積分?jǐn)?shù)5%血清的PBS重懸細(xì)胞,冰上放置10 min;加入飽和劑量FITC標(biāo)記的一抗,冰上放置40 min,離心去上清,PBS洗滌2次;加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%多聚甲醛重懸細(xì)胞;流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值,每管計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。
1.4 RT-PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄 SW480細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,加入不同濃度人參皂苷Rg3(0、20、80、320 μmol·L-1),繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后,Trizol法提取總RNA,用OD260/OD280鑒定RNA純度,質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂電泳鑒定完整性。取2 μg總RNA按TIANGEN公司試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)物cDNA進(jìn)行PCR。β-catenin引物序列上游:5'-ATGGCTTGGAATGAGAC-3',下游:5'-AACTGGATAGTCTAGCACC-3',產(chǎn)物大小 235 bp;β-actin引物序列上游:5'-ACTCGTCATACTCCCTGCTG-3',下游:5'-GAAACTACCTTCAACTCCC-3',產(chǎn)物大小285 bp;c-myc引物序列上游:5'-ATCTACACCGACAACTCCATCC-3',下游:5'-GCATTTTGGAGAGGAAGTGTTC-3',產(chǎn)物大小130 bp。擴(kuò)增條件為:94℃變性2 min,94 ℃變性40 s,62 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,40個(gè)循環(huán),72℃終延伸5 min。PCR電泳,Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像,Image Lab 3.0分析其相對(duì)分子質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) HCT116細(xì)胞接種于6孔板中(2×105/孔),藥物處理48 h。提蛋白并用BSA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。制膠,加樣品和Mark液后通電70 V、40 min,后改為120 V、1 h。轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到硝酸纖維素薄膜,按要求浸泡后按下列順序逐張疊放、精確對(duì)齊:3張濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、3張濾紙。插入電極,打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)調(diào)至80 mA、4 h。封閉1 h。加入一抗β-catenin 4℃過(guò)夜,后加入二抗孵育2 h。最后使用DAB顯色試劑盒,目標(biāo)蛋白顯色。使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像,相對(duì)灰度值=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白(β-actin)灰度值。
1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 用于研究人參皂苷Rg3對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。SW480及HCT116細(xì)胞種植到96孔板(1×104/孔,密度為60% ~80%)。常規(guī)培養(yǎng)24 h后,添加不同藥物濃度的人參皂苷Rg3(10、20、40、80、160、320 μmol·L-1)到 96 孔中,并設(shè)定實(shí)驗(yàn)對(duì)照及調(diào)零孔。體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育24、48 h后,添加10 μL MTT染液到每個(gè)指定的孔中,孵育4 h。隨后每孔加入150 μL DMSO以終止反應(yīng)和溶解甲臜,最后96孔板在490 nm處測(cè)定吸光值。
1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 實(shí)驗(yàn)使用Annexin-V FITC/PI雙染試劑盒。將SW480和HCT116細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞密度約80% ~90%,將細(xì)胞培養(yǎng)液換成不同濃度的人參皂苷Rg3(20、40、80、160、320 μmol·L-1),繼續(xù)培養(yǎng) 24、48 h。消化離心,按試劑盒要求加入Annexin V-FITC和PI染色液。在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,定量數(shù)據(jù)以±s來(lái)表示,2組定量數(shù)據(jù)比較使用t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。
2.1 β-catenin磷酸化程度 各人參皂苷Rg3用藥組(20、40、80、160、320 μmol·L-1)均比對(duì)照組的 βcatenin磷酸化程度低(P均<0.05),表示隨人參皂苷Rg3濃度的增加,β-catenin磷酸化信號(hào)強(qiáng)度明顯減弱。見(jiàn)圖1。
2.2 人參皂苷 Rg3作用48 h后對(duì)SW480細(xì)胞 βcatenin、c-myc mRNA的影響 隨人參皂苷Rg3濃度的增加,β-catenin mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化,且各人參皂苷Rg3用藥組mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);c-myc mRNA表達(dá)則是:隨人參皂苷Rg3濃度的增加,c-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低,一定濃度的人參皂苷 Rg3(80、320 μmol·L-1)用藥組c-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖2、表1。
表1 Rg3對(duì)SW480細(xì)胞β-catenin、c-myc mRNA的影響
2.3 人參皂苷Rg3作用48 h后對(duì)HCT116細(xì)胞βcatenin、c-myc蛋白的影響 隨人參皂苷Rg3濃度的增加,c-myc蛋白表達(dá)明顯降低,各人參皂苷Rg3用藥組β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖3、表2。
2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 不同濃度人參皂苷Rg3處理 SW480 細(xì)胞24 h后 IC50為102.027 4 ±3.275 1,48 h后 IC50為 37.096 9 ±0.172 9,下降 64.930 4 ±3.319 2;不同濃度人參皂苷Rg3處理HCT116細(xì)胞24 h 后 IC50為 96.591 0 ±0.634 9,48 h 后 IC50為37.445 6 ±1.339 1,下降59.145 4 ±1.498 3。不同時(shí)間,同一細(xì)胞株各濃度用藥組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。同一時(shí)間,不同細(xì)胞株各濃度用藥組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖4。
2.5 細(xì)胞凋亡情況 隨人參皂苷Rg3濃度的增加,時(shí)間的延長(zhǎng),SW480、HCT116細(xì)胞凋亡率顯著增加,各人參皂苷Rg3用藥組與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。不同時(shí)間,同一細(xì)胞株各濃度用藥組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。同一時(shí)間,不同細(xì)胞株各濃度用藥組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖5。
表2 Rg3對(duì)SW480細(xì)胞β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)的影響
β-catenin可通過(guò)與細(xì)胞膜上的鈣粘蛋白和細(xì)胞骨架的結(jié)合發(fā)揮重要的維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和黏附的作用。那么局限在細(xì)胞膜上的β-catenin是否能轉(zhuǎn)變成為游離形式而成為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的效應(yīng)因子這一問(wèn)題引起了廣泛的關(guān)注。研究[9]證明細(xì)胞質(zhì)中的激酶Fer可通過(guò)使 β-catenin第142位酪氨酸殘基(Tyr142或Y142)磷酸化而破壞其和α-catenin之間的連接,從而釋放β-catenin。因此,Y142位置的去磷酸化將穩(wěn)定β-catenin的膜結(jié)合形式,從而減少其參與Wnt/β-catenin信號(hào)通路,以致減少了下游促癌基因的轉(zhuǎn)錄。
在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3作用后的HCT116和SW480細(xì)胞中的游離β-catenin明顯減少,并且RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示這種減少效應(yīng)并不是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。我們使用特異識(shí)別β-catenin磷酸化Y142的抗體,在人參皂苷Rg3作用后,此位點(diǎn)的磷酸化水平下降。結(jié)合我們前期工作中預(yù)測(cè)到的人參皂苷Rg3可與β-catenin結(jié)合的模型,我們推測(cè)這種結(jié)合可以干擾Fer對(duì)于Y142的磷酸化過(guò)程,使得β-catenin保持穩(wěn)定的膜結(jié)合形式而不能發(fā)揮信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用,而在腫瘤細(xì)胞中則能減少下游一些促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展基因的表達(dá),進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡的發(fā)生,這些也在我們的實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。另外,在實(shí)驗(yàn)中,人參皂苷Rg3的作用呈現(xiàn)劑量依賴和隨時(shí)間增強(qiáng)的特點(diǎn),說(shuō)明人參皂苷Rg3可以使游離的β-catenin不斷地轉(zhuǎn)變成膜結(jié)合形式而加強(qiáng)效應(yīng),但我們注意到人參皂苷Rg3的效應(yīng)以80 μmol·L-1為界,在此之前,其抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的效應(yīng)隨濃度增加而迅速上升,而在此之后,隨濃度的增加,其效應(yīng)曲線則趨于平緩,這種現(xiàn)象說(shuō)明人參皂苷Rg3的效應(yīng)在80 μmol·L-1時(shí)趨于飽和,同時(shí)也表明了這種小分子物質(zhì)是通過(guò)與β-catenin結(jié)合而影響其功能的。但使游離形式β-catenin轉(zhuǎn)變的具體途徑和過(guò)程還需要通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。
人參皂苷Rg3的抗腫瘤作用具有這樣的機(jī)制使之與其他針對(duì)β-catenin的靶向治療方法相比,就有一定的優(yōu)勢(shì)。其中一種方法是試圖通過(guò)減少β-catenin的表達(dá)達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。例如將干擾RNA分別轉(zhuǎn)染至含有突變型β-catenin的SW480和HCT116細(xì)胞中,可減少β-catenin的表達(dá)、β-catenin/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄以及很好抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。但這種方法的主要缺陷就是通過(guò)抑制β-catenin的表達(dá),不僅減少其游離形式,同時(shí)也減少了參與細(xì)胞黏附的膜結(jié)合形式的數(shù)量,從而使得腫瘤組織容易發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。而人參皂苷Rg3則是在β-catenin總量不變的情況下,使參與信號(hào)通路的游離形式轉(zhuǎn)變成為膜結(jié)合形式,在達(dá)到降低β-catenin和靶基因轉(zhuǎn)錄的同時(shí),還穩(wěn)定了細(xì)胞黏附而減少腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。另外一些方法集中在對(duì)β-catenin降解復(fù)合體的改造上,這些方法克服了前述方法的缺點(diǎn),僅減少游離形式的βcatenin,而不影響細(xì)胞的黏附作用[11-12]。不過(guò)這些方法的復(fù)雜給藥方式則阻礙其應(yīng)用。因此人參皂苷Rg3簡(jiǎn)單的給藥方式和便捷的給藥途徑也成為其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。
綜上所述,人參皂苷Rg3具有一定的抗腫瘤活性,可有效抑制HCT116和SW480細(xì)胞生長(zhǎng),且這種作用可能是通過(guò)下調(diào)β-catenin磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。相信不久的將來(lái),隨著人們對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抗腫瘤機(jī)制的深入研究,針對(duì)該信號(hào)通路的不同靶點(diǎn)和高度特異性的天然小分子藥物的開(kāi)發(fā)將為腫瘤的診治提供一個(gè)嶄新的研究領(lǐng)域。
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