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        釀酒酵母的原生質(zhì)體誘變育種

        2012-10-15 12:55:10胡家俊方尚玲
        科技傳播 2012年8期
        關(guān)鍵詞:酵母菌

        楊 鑫,胡家俊,方尚玲

        湖北工業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430068

        酵母菌的菌落與細(xì)菌有相像的特征,但酵母菌的菌落小而薄,酵母菌的菌落質(zhì)地均勻,表面平整,粘稠,酵母菌的各個(gè)部位的顏色都很平均。酵母菌發(fā)酵所需的條件就是其生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖所需的條件,因?yàn)榫凭l(fā)酵只有在酵母菌出芽繁殖的條件下才能進(jìn)行,而當(dāng)發(fā)酵停止得時(shí)候,酵母菌就會(huì)停止生長(zhǎng)并死亡。

        1 試驗(yàn)材料

        1.1 樣品

        釀酒酵母:實(shí)驗(yàn)室冷凍保藏菌株。

        1.2 培養(yǎng)基

        液體YPD培養(yǎng)基;固體YPD培養(yǎng)基;TTC上層培養(yǎng)基;TIC下層培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基;高滲再生完全培養(yǎng)基;滲透壓穩(wěn)定劑;蝸牛酶酶液;脫壁預(yù)處理劑

        2 方法

        2.1 酵母菌原生質(zhì)體形成與再生條件研究

        2.1.1 酵母菌原生質(zhì)體制備[1]

        在YPD培養(yǎng)基斜面上將菌株活化并分別接種于三角瓶中,30℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期。將上述培養(yǎng)液3500r/min離心10min。為了盡可能的避免含有雜質(zhì),將使用無(wú)菌水沖洗離心。將親本細(xì)胞懸浮脫壁預(yù)處理溶液中,振蕩,離心收集菌體。將菌體懸浮于3mL的蝸牛酶液中,30℃振蕩培養(yǎng)。對(duì)其原生質(zhì)形態(tài)進(jìn)行跟蹤觀察,當(dāng)形成率達(dá)90%以上時(shí),停止反應(yīng),收集原生質(zhì)體細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行離心和沖洗以后將細(xì)胞懸浮于滲透壓穩(wěn)定劑中。

        2.1.2 酵母菌原生質(zhì)體形成與再生條件正交試驗(yàn)

        從表1可以知道酵母菌原生質(zhì)體形成與再生的最佳條件是通過(guò)酶解時(shí)間,蝸牛酶濃度,選取脫壁預(yù)處理時(shí)間這三個(gè)因素的三水平正交試驗(yàn)得來(lái)的。

        表1 正交試驗(yàn)因素水平表

        2.1.3 酵母菌原生質(zhì)體形成率與再生率[2]的計(jì)算

        1)總菌落數(shù);

        2)未形成原生質(zhì)體的菌落數(shù);

        3)酶處理后未形成原生質(zhì)體的菌落數(shù)和原生質(zhì)體再生的菌落數(shù)之和:

        原生質(zhì)體形成率(%)=(A-B)/A×100%原生質(zhì)體再生率(%)=(C-B)/(A-B)×100%

        2.2 原生質(zhì)體紫外誘變育種

        2.2.1 酵母菌原生質(zhì)體紫外誘變株[3]的篩選

        取原生質(zhì)體菌懸液于無(wú)菌平皿中,對(duì)原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行紫外誘變,將照射后的菌液直接涂布于高滲再生平板和固體YPD平板,置于30℃避光恢復(fù)培養(yǎng)。然后將菌落分別接種于斜面平板。

        1)初篩(TTC法)

        在一定培養(yǎng)基上培養(yǎng)的酵母菌落上與TTC顯色劑會(huì)呈現(xiàn)不同的色差反應(yīng),當(dāng)顏色為白色時(shí),可能為野生菌落,當(dāng)顏色為深紅時(shí),可能是產(chǎn)量高的菌落,當(dāng)為粉紅時(shí)可能產(chǎn)量要弱些。在TTC下層培養(yǎng)基中接入誘變后的菌株,培養(yǎng)24h,長(zhǎng)出菌落,然后倒入TTC上層培養(yǎng)基,30℃下保溫(陰暗處)2h~3h。比較各菌株之間的產(chǎn)酒精能力。

        2)復(fù)篩

        將含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中接入初篩時(shí)使用TTC法篩出的的優(yōu)良菌株并按10%的比例接入酵母菌株,于30℃下靜止發(fā)酵。每隔12h測(cè)一次二氧化碳失重,72h后可以認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵醪液酒精濃度、殘?zhí)恰?/p>

        2.2.2 各參數(shù)的測(cè)定方法

        1)殘還原糖量[4]:DNS法;2)發(fā)酵醪液酒精濃度[5]:蒸餾法;3)二氧化碳失重的測(cè)定:直接稱重法。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 酵母菌原生質(zhì)體形成與再生條件研究

        表2 酵母菌原生質(zhì)體形成與再生正交試驗(yàn)結(jié)果

        酵母菌原生質(zhì)體形成與再生正交試驗(yàn)結(jié)果:

        由表2可知,在脫壁預(yù)處理20min,然后1%的蝸牛酶酶解0.5h的條件下,得出原生質(zhì)體形成率為和再生率分別為89.7%和19.3%。

        3.2 誘變株的篩選

        為保證得到性狀優(yōu)良的突變菌株,本試驗(yàn)采用了紫外誘變方法對(duì)酵母菌株進(jìn)行原生質(zhì)體誘變。最終從再生平板中共得到20株誘變株。經(jīng)過(guò)初篩(TTC法)得到5株呈現(xiàn)深紅色的酵母菌落。再將這5株菌株經(jīng)過(guò)復(fù)篩得到各個(gè)菌株的發(fā)酵特性。

        表3 誘變株的篩選

        由表3可知,相對(duì)于出發(fā)菌株W酒精產(chǎn)量有所提高的誘變株有3株,占所有突變株的比例為15%。其中突變株W9產(chǎn)酒精量最高,為6.0%,相對(duì)于出發(fā)菌株W產(chǎn)酒精量提高了22.95%。殘還原糖含量為6.08mg/mL,相對(duì)于出發(fā)菌株W的6.35mg/mL,相差不大。負(fù)突變株W10產(chǎn)酒精量最低,僅為4.12%。

        4 結(jié)論

        1)通過(guò)對(duì)原生質(zhì)體形成與再生正交試驗(yàn)而得到最佳條件如下:在先脫壁預(yù)處理20min,然后1%的蝸牛酶酶解30min的條件下,得出原生質(zhì)體形成率為和再生率分別為89.7%和19.3%;

        2)通過(guò)初篩和復(fù)篩,獲得5株在發(fā)酵性能上優(yōu)越的菌株,初篩中的定性篩選是一個(gè)高通量的分析,明確刪除不符合要求的發(fā)酵能力弱的菌株。復(fù)篩是一個(gè)定量分析,可以將高產(chǎn)酒精的菌株給篩出。本次試驗(yàn)在篩選的初篩中加入了TTC顯色劑,因此在初篩的時(shí)候刪去發(fā)酵能力弱的菌株,減少了復(fù)篩的使用率,說(shuō)明TTC對(duì)于篩選高產(chǎn)酒精酵母菌也很有用;

        3)采用原生質(zhì)體紫外誘變方法,選育得到一株遺傳性狀穩(wěn)定的突變株W9,發(fā)酵72h后,其成熟醪酒精體積分?jǐn)?shù)為6.0%,殘還原糖含量為6.08mg/mL,對(duì)比出發(fā)菌株W,W9產(chǎn)酒精量提高22.95%。

        [1]詹萍,蘇龍,周乃東.紅酵母原生質(zhì)體制備和再生條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(3).

        [2]張華山,等.釀酒酵母與糖化酵母原生質(zhì)體的形成與再生[J].武漢理工大學(xué)學(xué)報(bào),2006(7).

        [3]曹禮,等.釀酒酵母菌的紫外誘變及其突變株的性能測(cè)[J].中國(guó)釀造,2009(10).

        [4]黃潔,等.蘋(píng)果發(fā)酵液中殘余還原糖的測(cè)定方法比較[J].工業(yè)微生物,2001(3).

        [5]許宏賢,等.溫度對(duì)超高濃度酒精生料發(fā)酵體系的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2010(3).

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