楊 鑫，胡家俊，方尚玲

湖北工業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430068

酵母菌的菌落與細(xì)菌有相像的特征，但酵母菌的菌落小而薄，酵母菌的菌落質(zhì)地均勻，表面平整，粘稠，酵母菌的各個(gè)部位的顏色都很平均。酵母菌發(fā)酵所需的條件就是其生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖所需的條件，因?yàn)榫凭l(fā)酵只有在酵母菌出芽繁殖的條件下才能進(jìn)行，而當(dāng)發(fā)酵停止得時(shí)候，酵母菌就會(huì)停止生長(zhǎng)并死亡。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣品

釀酒酵母：實(shí)驗(yàn)室冷凍保藏菌株。

1.2 培養(yǎng)基

液體YPD培養(yǎng)基；固體YPD培養(yǎng)基；TTC上層培養(yǎng)基；TIC下層培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基；高滲再生完全培養(yǎng)基；滲透壓穩(wěn)定劑；蝸牛酶酶液；脫壁預(yù)處理劑

2 方法

2.1 酵母菌原生質(zhì)體形成與再生條件研究

2.1.1 酵母菌原生質(zhì)體制備[1]

在YPD培養(yǎng)基斜面上將菌株活化并分別接種于三角瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期。將上述培養(yǎng)液3500r/min離心10min。為了盡可能的避免含有雜質(zhì)，將使用無(wú)菌水沖洗離心。將親本細(xì)胞懸浮脫壁預(yù)處理溶液中，振蕩，離心收集菌體。將菌體懸浮于3mL的蝸牛酶液中，30℃振蕩培養(yǎng)。對(duì)其原生質(zhì)形態(tài)進(jìn)行跟蹤觀察，當(dāng)形成率達(dá)90%以上時(shí)，停止反應(yīng)，收集原生質(zhì)體細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行離心和沖洗以后將細(xì)胞懸浮于滲透壓穩(wěn)定劑中。

2.1.2 酵母菌原生質(zhì)體形成與再生條件正交試驗(yàn)

從表1可以知道酵母菌原生質(zhì)體形成與再生的最佳條件是通過(guò)酶解時(shí)間，蝸牛酶濃度，選取脫壁預(yù)處理時(shí)間這三個(gè)因素的三水平正交試驗(yàn)得來(lái)的。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.1.3 酵母菌原生質(zhì)體形成率與再生率[2]的計(jì)算

1）總菌落數(shù)；

2）未形成原生質(zhì)體的菌落數(shù)；

3）酶處理后未形成原生質(zhì)體的菌落數(shù)和原生質(zhì)體再生的菌落數(shù)之和：

原生質(zhì)體形成率（%）=（A-B）/A×100%原生質(zhì)體再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100%

2.2 原生質(zhì)體紫外誘變育種

2.2.1 酵母菌原生質(zhì)體紫外誘變株[3]的篩選

取原生質(zhì)體菌懸液于無(wú)菌平皿中，對(duì)原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行紫外誘變，將照射后的菌液直接涂布于高滲再生平板和固體YPD平板，置于30℃避光恢復(fù)培養(yǎng)。然后將菌落分別接種于斜面平板。

1）初篩（TTC法）

在一定培養(yǎng)基上培養(yǎng)的酵母菌落上與TTC顯色劑會(huì)呈現(xiàn)不同的色差反應(yīng)，當(dāng)顏色為白色時(shí)，可能為野生菌落，當(dāng)顏色為深紅時(shí)，可能是產(chǎn)量高的菌落，當(dāng)為粉紅時(shí)可能產(chǎn)量要弱些。在TTC下層培養(yǎng)基中接入誘變后的菌株，培養(yǎng)24h，長(zhǎng)出菌落，然后倒入TTC上層培養(yǎng)基，30℃下保溫（陰暗處）2h～3h。比較各菌株之間的產(chǎn)酒精能力。

2）復(fù)篩

將含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中接入初篩時(shí)使用TTC法篩出的的優(yōu)良菌株并按10%的比例接入酵母菌株，于30℃下靜止發(fā)酵。每隔12h測(cè)一次二氧化碳失重，72h后可以認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵醪液酒精濃度、殘?zhí)恰?/p>

2.2.2 各參數(shù)的測(cè)定方法

1）殘還原糖量[4]：DNS法；2）發(fā)酵醪液酒精濃度[5]：蒸餾法；3）二氧化碳失重的測(cè)定：直接稱重法。

3 結(jié)果與討論

3.1 酵母菌原生質(zhì)體形成與再生條件研究

表2 酵母菌原生質(zhì)體形成與再生正交試驗(yàn)結(jié)果

酵母菌原生質(zhì)體形成與再生正交試驗(yàn)結(jié)果：

由表2可知，在脫壁預(yù)處理20min，然后1%的蝸牛酶酶解0.5h的條件下，得出原生質(zhì)體形成率為和再生率分別為89.7%和19.3%。

3.2 誘變株的篩選

為保證得到性狀優(yōu)良的突變菌株，本試驗(yàn)采用了紫外誘變方法對(duì)酵母菌株進(jìn)行原生質(zhì)體誘變。最終從再生平板中共得到20株誘變株。經(jīng)過(guò)初篩（TTC法）得到5株呈現(xiàn)深紅色的酵母菌落。再將這5株菌株經(jīng)過(guò)復(fù)篩得到各個(gè)菌株的發(fā)酵特性。

表3 誘變株的篩選

由表3可知，相對(duì)于出發(fā)菌株W酒精產(chǎn)量有所提高的誘變株有3株，占所有突變株的比例為15%。其中突變株W9產(chǎn)酒精量最高，為6.0%，相對(duì)于出發(fā)菌株W產(chǎn)酒精量提高了22.95%。殘還原糖含量為6.08mg/mL，相對(duì)于出發(fā)菌株W的6.35mg/mL，相差不大。負(fù)突變株W10產(chǎn)酒精量最低，僅為4.12%。

4 結(jié)論

1）通過(guò)對(duì)原生質(zhì)體形成與再生正交試驗(yàn)而得到最佳條件如下：在先脫壁預(yù)處理20min，然后1%的蝸牛酶酶解30min的條件下，得出原生質(zhì)體形成率為和再生率分別為89.7%和19.3%；

2）通過(guò)初篩和復(fù)篩，獲得5株在發(fā)酵性能上優(yōu)越的菌株，初篩中的定性篩選是一個(gè)高通量的分析，明確刪除不符合要求的發(fā)酵能力弱的菌株。復(fù)篩是一個(gè)定量分析，可以將高產(chǎn)酒精的菌株給篩出。本次試驗(yàn)在篩選的初篩中加入了TTC顯色劑，因此在初篩的時(shí)候刪去發(fā)酵能力弱的菌株，減少了復(fù)篩的使用率，說(shuō)明TTC對(duì)于篩選高產(chǎn)酒精酵母菌也很有用；

3）采用原生質(zhì)體紫外誘變方法，選育得到一株遺傳性狀穩(wěn)定的突變株W9，發(fā)酵72h后，其成熟醪酒精體積分?jǐn)?shù)為6.0%，殘還原糖含量為6.08mg/mL，對(duì)比出發(fā)菌株W，W9產(chǎn)酒精量提高22.95%。

[1]詹萍，蘇龍，周乃東.紅酵母原生質(zhì)體制備和再生條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(3).

[2]張華山，等.釀酒酵母與糖化酵母原生質(zhì)體的形成與再生[J].武漢理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2006(7).

[3]曹禮，等.釀酒酵母菌的紫外誘變及其突變株的性能測(cè)[J].中國(guó)釀造，2009(10).

[4]黃潔，等.蘋(píng)果發(fā)酵液中殘余還原糖的測(cè)定方法比較[J].工業(yè)微生物，2001(3).

[5]許宏賢，等.溫度對(duì)超高濃度酒精生料發(fā)酵體系的影響[J].生物工程學(xué)報(bào)，2010(3).