邵錦挺，應國清，王 琦，梅建鳳，王 鴻，易 喻

（1.浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州310032；2.加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)業(yè)食品部圭爾夫食品研究中心，加拿大 圭爾夫N1G5C9）

3，5－二硝基水楊酸（DNS）比色法是還原糖測定的一種常用的經(jīng)典方法，廣泛應用于各種糖類測定實驗［1－2］.有關該方法的研究改進主要集中在考察試劑添加量、顯色時間、檢測波長等因素對測定結(jié)果的影響［3］.但傳統(tǒng)DNS法仍然存在一些缺陷，比如對微量樣品檢測難以進行，對大批量的樣品檢測又顯得操作繁瑣，故有必要將傳統(tǒng)DNS法進行微型化.酶聯(lián)免疫測試儀（酶標儀）是近年來實驗室中逐漸普及的檢測儀器之一，目前主要應用于酶聯(lián)免疫檢測（ELISA），其工作原理與分光光度計相同都是依據(jù)朗伯－比爾定律［4］，但其一次性檢查樣品可達96個，是分光光度計一次性可檢查樣品數(shù)量的幾十倍，因此采用酶標儀代替分光光度計分析能有效提高檢測效率，故將傳統(tǒng)DNS法進行改進并建立微型化DNS法，采用酶標儀檢測吸光度測定還原糖含量以達到檢測簡便、快速和樣品用量少等目的.

1 材料與方法

1.1 試 劑

標準品葡萄糖、3，5－二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、苯酚等試劑均為市售分析純.

1.2 儀 器

主要儀器紫外可見分光光度計（上海尤尼柯公司，UV－2000型）、酶標儀（美國分子儀器有限公司，Spectramax M2型）.

1.3 DNS試劑配制

稱取185g酒石酸鉀鈉溶于500mL蒸餾水，加熱至45℃，再加入6.3g的3，5－二硝基水楊酸和262mL氫氧化鈉（2mol／L）溶液，溶解后加入5g苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解.冷卻后加蒸餾水定容至1 000mL，貯存于棕色瓶中暗處保存7d備用［5］.

1.4 還原糖的測定

1.4.1 傳統(tǒng)DNS分光光度法

精確稱取0.100g葡萄糖，蒸餾水溶解并定容至100mL.分別取上述葡萄糖標準溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于相應編號具塞試管中，再分別加入蒸餾水1.0，0.9，0.8，0.7，0.6，0.5mL，再各加DNS試劑1mL，混勻后于沸水浴中加熱5min，流水冷卻后分別向各試管中加入8mL蒸餾水，混勻，以0號管為空白對照，用紫外可見分光光度計測定各管溶液波長為540nm下吸光度.以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度（A540）為縱坐標繪制標準曲線.

1.4.2 微型化DNS法

精確稱取0.100g的葡萄糖，蒸餾水溶解并定容至100mL.取上述葡萄糖標準溶液分別20，40，60，80，100μL于相應編號的1.5mL的塑料離心管中，再分別加入蒸餾水80，60，40，20，0μL，再各加DNS試劑100μL，混勻后于沸水浴中加熱5min，流水冷卻后分別向各試管中加入800μL蒸餾水，混勻，每管移取200μL于96孔板中，用酶標儀檢測各管540nm波長下的吸光度.以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度（A540）為縱坐標繪制標準曲線.

2 結(jié)果與分析

2.1 DNS標準曲線

如方法1.4所述，分別繪制傳統(tǒng)DNS法和微型化DNS法標準曲線.以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，A540為縱坐標，繪制的標準曲線見圖1.由圖1可見，微型化DNS法標準曲線顯示，葡萄糖質(zhì)量濃度在0.2～1.0mg／mL圍內(nèi)，與A540的線性關系良好，得到回歸方程A＝0.890 5C－0.022 7，R2＝0.999 4，檢出限為0.028mg／mL.由標準曲線的斜率可以看出，微型化DNS法的靈敏度不如傳統(tǒng)DNS法，但能滿足實驗測定的需要.

圖1 葡萄糖質(zhì)量濃度—A540的標準曲線Fig.1 Specification curve for calculating glucose mass concentration by A540

2.2 重復性實驗

將一定量瓊脂加入到0.4mol／L鹽酸中，于60℃水浴中水解4h，反應完后取出并加入氫氧化鈉中和至中性，冷卻后經(jīng)8 000r／min離心5min后得上清液為瓊脂多糖水解液樣品.用微型化DNS法檢測吸光度，用2.1中得出的標準曲線計算樣品中還原糖質(zhì)量濃度，重復測定5次，結(jié)果見表1，計算得RSD為1.36%，表明微型化DNS法有較好的精密度.

表1 重復性實驗數(shù)據(jù)Table 1 Date of duplicated experiment

2.3 加樣回收率實驗

用微型化DNS法測定2.2中的瓊脂多糖水解液中的還原糖含量，再分別添加葡萄糖標準品溶液，使樣品中的葡萄糖的添加質(zhì)量濃度分別為0.2，0.3，0.4，0.5mg／mL，微型化 DNS法測定樣品中還原糖的總質(zhì)量濃度，結(jié)果見表2.計算回收率和RSD，兩者分別為100.6%和1.74%.表明微型化DNS法精確性較好.

表2 回收率實驗數(shù)據(jù)Table 2 Date of returns－ratio experiment

2.4 傳統(tǒng)DNS法和微型化DNS法檢測樣品的比較

取葡萄糖水溶液5份和瓊脂多糖水解液樣品5份，分別以傳統(tǒng)DNS法和微型化DNS法測定還原糖質(zhì)量濃度.對兩種分析方法測定結(jié)果進行t檢驗，比較差異情況.考察兩種方法檢測差異情況，其中樣品的測定結(jié)果見表3.兩種分析方法測定含葡萄糖樣品和多糖水解液樣品結(jié)果分別進行t檢驗，P值分別為0.114 0和0.118 1（＞0.05），說明兩種方法測定結(jié)果無顯著差異.

表3 還原糖質(zhì)量濃度Table 3 Reducing sugar mass concentration mg／mL

3 結(jié) 論

采用酶標儀為檢測工具建立的微型化DNS法，其檢測還原糖含量的標準曲線回歸方程為A＝0.890 5C－0.022 7，R2＝0.999 4，線性范圍為0.2～1.0mg／mL.樣 品 加 樣 回 收 率 為 99.0% ～103.0%，重現(xiàn)性好，RSD為1.74%.比較傳統(tǒng)DNS法與微型化DNS法測定樣品，對測定結(jié)果進行t檢驗，P＝0.118 1（＞0.05）表明兩種方法檢測到結(jié)果無明顯差異，證實微型化DNS法是切實可行的.由于酶標儀對樣品進行檢測效率是分光光度計檢測效率的幾十倍，微型化DNS法檢測所需樣品量為傳統(tǒng)DNS法的十分之一甚至更少，故微型化DNS法有望切實提高批量樣品還原糖含量的檢測效率以及對微量樣品進行檢測.

［1］夏春森，韋史利，鐘艷紅.3，5－二硝基水楊酸比色法測定黃芪多糖的含量［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2009（8）：13－14.

［2］孫小丁，姜守剛，楊麗新.DNS法測定谷氨酸發(fā)酵過程中總糖的研究［J］.發(fā)酵科技通訊，2009，38（3）：22－25.

［3］趙凱，許鵬舉，谷廣燁.3，5－二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究［J］.食品科學，2008，29（8）：534－536.

［4］李明兆，盧瑞祥.酶標儀性能評價和校準方法的探討［J］.中國測試技術，2005，31（4）：100－101.

［5］張波.生物化學與分子生物學實驗教程［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2009.