楊 春，程文亮，梅建鳳，易 喻，陳建澍，應(yīng)國清，王 鴻

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州310032；2.浙江麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水323000）

柳葉臘梅（ChimonanthussalicifoliusHu）又名山蠟梅、亮葉蠟梅、毛山茶、巖馬桑、香風(fēng)茶、石涼茶等，為蠟梅科蠟梅屬常綠灌木.畬民主要用于治療傷食所致的痞滿證和慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍引起的胃脹、胃痛、泛酸等，還用于防治感冒和流行性感冒.柳葉臘梅葉具有濃郁的香味，其精油成分不僅有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、祛痰作用，還能抑制食欲，明顯減緩小鼠體重增長(zhǎng)，起到減肥作用.該藥使用歷史悠久、療效確切、副作用較少，是值得研究開發(fā)的藥茶多用品種.經(jīng)國家有關(guān)科研單位測(cè)定，柳葉臘梅含揮發(fā)油、槲皮素、堿、黃酮類等多種有效性成分，鐵、鈣、鋅、鎂、硒等微量元素及維生素B1、維生素B2、維生素C等含量豐富，并含18種氨基酸［1－4］.目前，對(duì)蠟梅屬（Chimonanthus）植物化學(xué)成分的研究主要以揮發(fā)性精油為主，非揮發(fā)性成分研究甚少.揮發(fā)性化學(xué)成分又以柳葉臘梅葉油成分研究為多，其他器官中化學(xué)成分尚未見報(bào)道.我們通過對(duì)其枝干部的研究，確證其活性成分為香豆素類化合物，主要為6，7－二甲氧基香豆素（化合物1）和6，7，8－三甲氧基香豆素（化合物2）［5－12］.傳統(tǒng)的提取多采用傳統(tǒng)的浸泡法和熱回流法，這些提取方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且效率低下.本研究以超聲輔助提取技術(shù)和萃取技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

柳葉臘梅經(jīng)浙江麗水農(nóng)科院程文亮教授鑒定為臘梅科植物柳葉臘梅chimonanthus salicifous hu；無水乙醇購自安徽安特生物化學(xué)有限公司；色譜甲醇為上海陸都化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；液相色譜儀由日本島津公司生產(chǎn)，型號(hào)為shim－pack Vp－ods；反相硅膠柱為Agilent Eclipse有限公司生產(chǎn)，型號(hào)為XDBC18（5μm×4.615 0mm）；數(shù)控超聲波清洗器是昆山市超聲儀有限公司生產(chǎn)的KQ－100型.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為 Agilent Eclipse XDB－C18（5μm×4.6×150mm）；流速為1mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)為326nm；流動(dòng)相為V（甲醇）∶V（水）＝45∶65.

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取6，7－二甲氧基香豆素（化合物1）和6，7，8－三甲氧基香豆素（化合物2）各5mg，用甲醇定容于100mL容量瓶中.分別配制成質(zhì)量濃度為5，4，3，2，1μg／mL溶液，液相譜圖如圖1所示，以峰面積y對(duì)化合物質(zhì)量濃度x進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為

化合物1：y＝300 000x＋38 545，R2＝0.999 3

化合物2：y＝180 000x＋10 709，R2＝0.999 7

圖1 兩種香豆素類化合物的保留時(shí)間Fig.1 The retention times of tow compounds

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

乙醇廉價(jià)易得，基本無毒副作用，可回收利用，且對(duì)香豆素的溶解能力強(qiáng)，故采用乙醇超聲輔助提取工藝.以6，7－二甲氧基香豆素和6，7，8－三甲氧基香豆素提取量為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察超聲時(shí)間、乙醇溶液用量和乙醇體積分?jǐn)?shù)三個(gè)因素.

1.2.3.1 超聲時(shí)間

稱取柳葉臘梅枝粉碎物若干份，每份1g，每組5個(gè)平行樣，分別加入50%乙醇溶液20mL，超聲時(shí)間及結(jié)果見圖2.由圖2可知：當(dāng)超聲時(shí)間在1h時(shí)對(duì)提取量基本無影響，所以超聲時(shí)間定為1h.

圖2 超聲時(shí)間對(duì)峰面積的影響Fig.2 Ultrasonic time on the influence of peak area

1.2.3.2 乙醇溶液用量

稱取臘梅枝粉碎物若干份，每份1g，每組5個(gè)平行樣，加入50%乙醇溶液，超聲時(shí)間為1h，加入體積及結(jié)果見圖3.由圖3可知當(dāng)加入體積在30mL時(shí)對(duì)提取量基本無影響，所以乙醇用量定為30mL.

圖3 乙醇溶液用量對(duì)峰面積的影響Fig.3 Ethanol solution dosage on the influence of peak area

1.2.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)

稱取臘梅枝粉碎物若干份，每份1g，每組5個(gè)平行樣，加入體積為30mL，超聲時(shí)間為1h，乙醇用量及結(jié)果見圖4.由圖4可知當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)提取量基本為最大，所以乙醇體積分?jǐn)?shù)定為70%.

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)峰面積的影響Fig.4 Ethanol volume fraction on the influence of peak area

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上上，按（L34）正交表，以浸膏中6，7－二甲氧基香豆素的提取量為考核指標(biāo)，考察超聲時(shí)間（A）、乙醇溶液用量（B）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3水平，其因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1Orthogonal experiment factor levels list

由表2可見：各因素作用主次為C＞B＞A，即乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)制劑中6，7－二甲氧基香豆素提取量影響最大，乙醇溶液用量次之，而超聲時(shí)間影響最小.A因素中以K2：最大；B因素中以K3最大；C因素中以K3最大，故最佳工藝條件為A2B3C3，即用80%的乙醇40mL，超聲提取1h，含量最高.經(jīng)過驗(yàn)證，與此結(jié)果相符，6，7－二甲氧基香豆素和6，7，8－三甲氧基香豆素的提取量分別為0.23mg／g和0.76mg／g，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均按此條件提取.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Orthogonal test results

2.2 香豆素類化合物的純化

按照上述條件進(jìn)行超聲提取，然后過濾得提取液，再將濾液旋轉(zhuǎn)濃縮成浸膏狀，在用V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）＝1∶1∶1來進(jìn)行萃取.其中上相主要為水層，下相主要為氯仿層，靜置片刻后用分液漏斗得下相.將下相蒸干得浸膏狀物，加入水并濾去沉淀得到兩種香豆素類混合物的溶液，經(jīng)過HPLC檢測(cè)香豆素類混合物的總體積分?jǐn)?shù)為96%，香豆素類化合物分別為6，7－二甲氧基香豆素和6，7，8－三甲氧基香豆素.

3 結(jié) 論

萃取技術(shù)方便快捷、獲得目標(biāo)物產(chǎn)量高、溶劑可回收利用.先用80%的乙醇40mL，超聲提取1h，得到柳葉臘梅浸膏.通過對(duì)幾個(gè)溶劑體系的研究，我們選擇了V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）＝1∶1∶1.綜上所述，應(yīng)用萃取方法可以快速的獲得高純的香豆素類化合物，本方法分離效果好，提取量高，產(chǎn)品純度高，時(shí)間短，操作方便，條件固定，易于重復(fù)，材料可重復(fù)使用，從而可以對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)提供參考.

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