楊根生，包方廷，王文喜

（浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州310032）

自乳化藥物傳遞系統(tǒng) （Self－emulsifying drug delivery systems，SEDDS）是由油相、乳化劑和助乳化劑形成的熱力學(xué)穩(wěn)定的均一、透明或半透明溶液，該系統(tǒng)可以在胃腸道內(nèi)或在輕微攪拌（37℃）的情況下自發(fā)形成水包油型乳劑（粒徑≤5μm）.隨著乳化劑用量的增多，粒徑可進(jìn)一步減?。健?00nm），此時(shí)稱(chēng)為自微乳化藥物傳遞系統(tǒng)（Self－microemulsifying drug delivery systems，SMEDDS）.SEDDS和SMEDDS能提高藥物溶解度，降低胃腸道副作用，提高疏水性、難吸收或易水解的藥物溶出度，增加小腸上皮的滲透性，降低或抑制P－糖蛋白藥物外排，有助于提高藥物的生物利用度等［1－2］.羥基喜樹(shù)堿（Hydroxycamptothecin）是從珙桐科旱蓮植物喜樹(shù)中分離得到的一種色氨酸－萜烯生物堿，在臨床上主要用于原發(fā)性肝癌、胃癌、慢性粒細(xì)胞白血病、直腸癌、膀胱癌的治療［3］.由于羥基喜樹(shù)堿溶解度較低，導(dǎo)致生物利用度不高，同時(shí)該藥物化學(xué)穩(wěn)定性差，內(nèi)酯環(huán)對(duì)pH敏感，開(kāi)環(huán)后抗癌活性降低90%，限制了其臨床應(yīng)用［4］.為了提高羥基喜樹(shù)堿口服吸收效果，增強(qiáng)療效，筆者開(kāi)展了制備羥基喜樹(shù)堿口服自乳化給藥系統(tǒng)（HCPT－SEDDS）的研究.

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

臺(tái)式漩渦振蕩儀（常州國(guó)華電器有限公司）；HH－4數(shù)顯恒溫水浴器（金壇市江南儀器廠(chǎng)）；KNAUER SY－4000K 型 高 效 液 相 色 譜 儀 （德 國(guó)KANUER有限公司）；Smartline Autosampler 3800自動(dòng)進(jìn)樣器（德國(guó)KANUER有限公司）；Hypersil C18色譜柱，250×4.6mm，5μm（大連依利特有限公司）；JEM透射電子顯微鏡（日本電子公司）；DelsaNano激光粒度測(cè)定儀（Beckman公司）；ZRS－8型智能溶出試驗(yàn)儀（天津大學(xué)儀器廠(chǎng)）.

1.2 藥品與試劑

羥基喜樹(shù)堿（HCPT，純度≥98%）購(gòu)置于上海龍翔科技有限公司；聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL）購(gòu)置于法國(guó)BASF；氫化玉米油（Maisine 35－1）、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）、油酸甘油酯（Peceol）、丙二醇二癸酸酯（Labrafac PG）和二乙烯基乙二醇單乙醚（Transcutol P）購(gòu)置于法國(guó)佳法賽；三丁酸甘油酯（Glyceryl tributyrate）購(gòu)置于莊信萬(wàn)豐公司（A Johnson Matthey Company）；油酸乙酯（Ethyl oleate）、油酸正丁酯（Butyl oleate）、肉豆蔻酸異丙酯（Isopropyl myristate）購(gòu)置于阿拉丁試劑公司；辛酸葵酸甘油酯（GTCC）購(gòu)置于北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司；甲醇為市購(gòu)色譜純，其余試劑為市購(gòu)分析純.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物在各輔料中平衡質(zhì)量濃度的考察

將過(guò)量HCPT置于具塞離心管中，分別加入油相、乳化劑或助乳化劑2.0mL.將混合物漩渦混勻，在37℃恒溫水浴中震蕩平衡72h，于5 000r／min離心5min，用甲醇稀釋適宜倍數(shù)后，用HPLC法測(cè)定HCPT含量，計(jì)算其在各輔料中的質(zhì)量濃度.選用的HPLC條件：色譜柱為 Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為V（甲醇）∶V（水）＝60∶40；檢測(cè)波長(zhǎng)為266nm；柱溫為室溫；流速為1.0mL／min.

1.3.2 三元相圖的繪制

根據(jù)質(zhì)量濃度考察和預(yù)先配伍試驗(yàn)結(jié)果，選定Maisine35－1和 GTCC作為油相，Cremophor EL和Labrasol作為乳化劑，Transcutol P作為助乳化劑.以Maisine35－1作為單一油相以及聯(lián)合使用Maisine35－1，GTCC作為混合油相的微乳區(qū)域比較進(jìn)行油相的考察.分別以Cremophor EL和Labrasol作為單一乳化劑時(shí)的微乳區(qū)域與使用混合乳化劑時(shí)的微乳區(qū)域進(jìn)行比較進(jìn)行乳化劑的篩選，其中定義Cremophor EL和Labrasol的質(zhì)量比為KM，依次考察KM＝1∶2，1∶1，2∶1，3∶1和4∶1四個(gè)比例的相圖情況.

稱(chēng)取Km1＝m（乳化劑）∶m（助乳化劑）分別為1∶4，1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1和4∶1七個(gè)比例；Km2＝m（油相）∶m（乳化劑＋助乳化劑）分別為1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1九個(gè)比例，總量為1g的不同處方［5］.漩渦震蕩使充分混勻，37℃恒溫水浴保溫2h.在不斷振搖下加入100mL去離子水，觀察過(guò)程現(xiàn)象和最終的成乳情況，以體系澄清透明或半透明，帶有淡藍(lán)色乳光作為考察標(biāo)準(zhǔn)，判斷能否形成微乳.

以油相、乳化劑和助乳化劑作為三元相圖的三個(gè)頂點(diǎn)，根據(jù)各組分在處方中所占總量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，利用Origin Pro8.0軟件繪制相圖.按Km1七個(gè)比例所對(duì)應(yīng)繪制Km2九個(gè)比例的一系列點(diǎn)，篩選其中能形成微乳的臨界點(diǎn)，與斜邊所組成的圖形從而得到相圖的微乳區(qū)域.

1.3.3 HCPT－SEDDS質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇及測(cè)定

理想的自乳化處方應(yīng)具有對(duì)藥物良好的溶解能力，應(yīng)在較短的時(shí)間內(nèi)快速分散成粒徑小而均勻的乳滴.因此，選擇處方對(duì)藥物的平衡質(zhì)量濃度、微乳的平均粒徑和處方的自乳化速率作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo).

1.3.3.1 藥物平衡質(zhì)量濃度的測(cè)定

將過(guò)量HCPT加到2.0g空白自乳化制劑中，密閉狀態(tài)下于37℃水浴中震蕩72h達(dá)到平衡，吸取上清液，離心5min（5 000r／min），精密吸取一定量的樣品，用色譜甲醇適量稀釋后，采用HPLC法測(cè)定HCPT含量，計(jì)算平衡質(zhì)量濃度.

1.3.3.2 粒徑測(cè)定

取 HCPT自乳化制劑0.5g，在37℃，50r／min磁力攪拌下滴加到100mL 0.1mol／L HCl中，待形成微乳后，采用DelsaNano激光粒度測(cè)定儀測(cè)定微乳的平均粒徑及粒徑分布.

1.3.3.3 自乳化速率的測(cè)定

取HCPT自乳化制劑適量，在37℃0.1mol／L HCl中，50r／min 攪拌，于 1，2，3，5，7，10，15，20min取液，在250nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度A，以20min測(cè)得的A0值作為100%，將吸收度達(dá)到100%的時(shí)間t作為完全乳化的時(shí)間.

1.3.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)－響應(yīng)面法優(yōu)選處方

在相圖考察的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)微乳形成有顯著性影響的兩個(gè)因素作為考察對(duì)象，即油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）和乳化劑與助乳化劑的比值（X2），實(shí)驗(yàn)采用兩因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)［6］，取值范圍X1為20～50，X2為1～4.各因素水平的代碼值和實(shí)際操作值由星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理確定，因素和水平見(jiàn)表1.

表1 各因素水平代碼值和實(shí)際操作物理量值Table 1 Independent variables and the correspondent values in coded and physical form

以處方中藥物平衡質(zhì)量濃度、微乳粒徑、自乳化速率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（因變量），以 Design－Expert 7.0.0為統(tǒng)計(jì)軟件，分別對(duì)各因素水平進(jìn)行二項(xiàng)式非線(xiàn)性擬合.以擬合方程的回歸系數(shù)r對(duì)方程進(jìn)行準(zhǔn)確性檢驗(yàn)，根據(jù)最優(yōu)方程繪制響應(yīng)面和等高線(xiàn)，分析各因素對(duì)各效應(yīng)值的影響，選取最佳優(yōu)化區(qū)，確定最優(yōu)處方.

1.3.5 優(yōu)化HCPT自乳化傳遞系統(tǒng)的制備

稱(chēng)取處方量的Labrasol和Transcutol P置于具塞三角錐瓶中，混勻后，加入HCPT原料藥，將三角錐瓶置于50℃水浴中，直至藥物完全溶解.然后依次加入一定量的 Cremophor EL，Maisine 35－1和GTCC，漩渦混勻，在50℃恒溫水浴中緩慢震蕩直至形成淡黃色均一溶液.

1.3.6 溶出度測(cè)定

將HCPT自乳化處方灌裝于硬膠囊中，按照（中國(guó)藥典）2010年版二部附錄XC第一法（轉(zhuǎn)籃法）［7］，溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為50r／min，溶出介質(zhì)為200mL 0.1mol／L HCl，分別于5，10，20，30，45，60，90，120min時(shí)取樣5mL，并補(bǔ)充同體積的溫度為（37±0.5）℃的溶出介質(zhì).再用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，采用HPLC法測(cè)定HCPT在不同時(shí)間點(diǎn)的溶出度，計(jì)算溶出百分率并繪制溶出曲線(xiàn).同時(shí)，用不含藥物的空白制劑作對(duì)照以消除體系濁度的影響.

1.3.7 微乳形態(tài)觀察

取HCPT－SEDDS用水稀釋100倍，形成半透明帶淡藍(lán)色乳光的微乳.將3%的磷鎢酸溶液滴到蠟板上，另將稀釋一定濃度的微乳滴加到銅網(wǎng)上，用濾紙吸取過(guò)多的樣品溶液，將銅網(wǎng)正面蓋在染液上負(fù)染20min，取出銅網(wǎng)，用濾紙吸取過(guò)多的染色液，在透射電鏡下觀察并照相.

1.3.8 初步穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

根據(jù)處方配比，制成HCPT－SEDDS制劑，密封于西林瓶中室溫保存，分別于0，1，2，3，6月末取樣，對(duì)其外觀、微乳粒徑、自乳化時(shí)間、1h累積溶出度與藥物含量進(jìn)行考察［8］.

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物在各輔料中平衡質(zhì)量濃度的考察

平衡質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果如表2所示（37℃）.HCPT在助乳化劑Transcutol P中的質(zhì)量濃度最大，在乳化劑Labrasol中的溶解度次之.

通過(guò)質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)及初步配伍試驗(yàn)選擇油相為Maisine 35－1和GTCC，乳化劑為Cremophor EL和Labrasol與助乳化劑Transcutol P.HCPT在一些油相中的質(zhì)量濃度也不是很理想，而在Labrasol和Transcutol P兩種溶劑中的質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他輔料.這可能由于HCPT一端是親油鏈，另一端是帶有羥基的親水鏈，而Labrasol和Transcutol P恰恰也是類(lèi)似的結(jié)構(gòu).他們對(duì)HCPT良好的溶解能力很好說(shuō)明了相似相容的原理.因此，在制備處方的時(shí)候，首先將HCPT完全溶解于Labrasol和Transcutol P，再依次加入其他組分，這樣混合才能有利于形成澄清、均一和穩(wěn)定的濃縮液.

表2 羥基喜樹(shù)堿在不同輔料中的平衡質(zhì)量濃度Table 2 The equilibrium solubility of HCPT in different solvents

2.2 三元相圖的繪制

相圖中用實(shí)線(xiàn)封閉的區(qū)域代表自乳化形成微乳的區(qū)域，黑點(diǎn)表示被考察的區(qū)域.由圖1（a，c）比較可知：混合油相m（Maisine35－1）∶m（GTCC）＝1∶1的自微乳區(qū)域明顯大于單獨(dú)使用Maisine35－1的區(qū)域.由圖1（a，b）比較可知：乳化劑為Cremophor EL的自微乳化區(qū)域要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Labrasol的自微乳化區(qū)域.單獨(dú)以Cremophor EL作為乳化劑時(shí)，乳化過(guò)程中有凝膠現(xiàn)象出現(xiàn)，自乳化速率較慢，所以考慮選擇混合乳化劑.聯(lián)合使用乳化劑Cremophor EL和Labrasol，一方面利用了Cremophor EL較強(qiáng)的乳化能力，另一方面利用了Labrasol良好的溶解性能，在保證乳化效果的同時(shí)提高了對(duì)藥物的溶解能力.通過(guò)比較圖1（d—g）可知：當(dāng)聯(lián)合使用Cremophor EL和Labrasol時(shí)，形成的自微乳區(qū)域還是比較大，并且隨著Cremophor EL與Labrasol比例的增大，自微乳區(qū)域增大，乳化速率減慢.

三元相圖的研究初步篩選出了處方的較佳組分組成.在綜合考慮質(zhì)量濃度和乳化能力的情況下，選擇了含碳數(shù)為8～10的油脂GTCC和含碳數(shù)為16的不飽和油脂Maisine 35－1聯(lián)合使用作為處方的油相.乳化劑選擇了HLB為12～14的Cremophor EL和HLB為12的Labrasol聯(lián)合使用.根據(jù)文獻(xiàn)［4］報(bào)道喜樹(shù)堿類(lèi)提取物為P－糖蛋白底物，自乳中的表面活性劑Cremophor EL和Labrasol可抑制P－糖蛋白的外排作用，降低藥物外排幾率，增加藥物的吸收.

圖1 不同組分形成差異性微乳區(qū)域的三元相圖Fig.1 The phase diagram of difference microemulsion area due to different compositions

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)－響應(yīng)面法優(yōu)化處方

大多數(shù)情況下，各因素對(duì)效應(yīng)的影響并非線(xiàn)性，而目前普遍采用正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝、篩選處方，即用線(xiàn)性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，實(shí)驗(yàn)次數(shù)雖少，但精度不夠，預(yù)測(cè)性較差.研究采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)－響應(yīng)面法對(duì)處方中不同成分的比例進(jìn)行了優(yōu)化，該方法遵循循序漸進(jìn)的原則，根據(jù)球面設(shè)計(jì)原理確定極值和水平，更適合于非線(xiàn)性擬合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)［9］.研究按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，安排了13次試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式非線(xiàn)性擬合，以方程回歸系數(shù)r最大且F檢驗(yàn)合格為原則，結(jié)果二次多項(xiàng)式擬合結(jié)果較好，得到回歸方程為

采用Design－Expert 7.0.0統(tǒng)計(jì)軟件繪制以上擬合方程的效應(yīng)面和等高線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2.

圖2 兩因素五水平非線(xiàn)性擬合的響應(yīng)面及其等高線(xiàn)Fig.2 Response surfaces and contour line of nonlinear fitting of two factors and five levels

2.4 最優(yōu)處方的確立

2.4.1 藥物平衡質(zhì)量濃度

增加HCPT溶解度是本實(shí)驗(yàn)的主要目的之一.結(jié)果表明：當(dāng)油相比例（X1）一定時(shí)，隨著乳化劑／組乳化劑比例（X2）的增大，體系對(duì)藥物的增溶能力是先減小后增大；固定X2比例時(shí)，增大油相比例導(dǎo)致增溶能力降低.從藥物在體系各成分中平衡質(zhì)量濃度的測(cè)定結(jié)果中，藥物在Transcutol P的質(zhì)量濃度最大，在一定范圍內(nèi)，體系對(duì)藥物的增溶能力依賴(lài)于助乳化劑Transcutol P的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

2.4.2 微乳粒徑

減小微乳的粒徑有利于提高藥物的吸收.結(jié)果表明：當(dāng)油相比例（X1）小于25%時(shí)，X2的變化對(duì)粒徑?jīng)]有明顯的影響，而當(dāng)油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，隨著X2的增大，微乳粒徑逐漸減小.當(dāng)X2一定時(shí)，隨著油相比例（X1）從20%增加到50%，粒徑增大趨勢(shì)明顯.所以要選擇一個(gè)合適的油相比例，在此基礎(chǔ)上選擇一個(gè)合適的乳化劑／組乳化劑比例，才能形成粒徑理想的微乳.

2.4.3 自乳化速率

自乳化速率越小說(shuō)明從濃縮液變?yōu)槲⑷樗钑r(shí)間越短，體系的效果越好.結(jié)果表明：當(dāng)油相比例（X1）一定時(shí)，隨著X2的增大，自乳化速率增大；當(dāng)固定X2時(shí)，自乳化速率隨著X1的增大而增大.當(dāng)乳化劑和油相的比例都增加的時(shí)候，體系從濃縮液變?yōu)槲⑷樗钑r(shí)間都延長(zhǎng).

理想的且體內(nèi)吸收良好的SEDDS應(yīng)該對(duì)藥物有較好的質(zhì)量濃度，能在較短的時(shí)間內(nèi)乳化，且得到粒徑較小的微乳.本研究中規(guī)定HCPT－SEDDS的優(yōu)化處方應(yīng)滿(mǎn)足以下指標(biāo)：藥物平衡質(zhì)量濃度≥1mg／mL，微乳粒徑≤40nm，自乳化速率為4min左右或者更短.依據(jù)上述指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)，選出因素最佳取值范圍為：X1＝25～35，X2＝1.25～2.0，以油相用量盡量多和形成粒徑盡量小的原則，最后確定Km1＝2∶1，Km2＝35∶65為最優(yōu)處方，見(jiàn)表3.

表3 最優(yōu)HCPT－SEDDS濃縮液中各成分及其比例Table 3 The ingredients and proportion in the optimal HCPT－SEDDS concentrate

2.4.4 溶出度及其微乳粒徑的測(cè)定和形態(tài)觀察

HCPT的SEDDS膠囊與其粉末膠囊的累積溶出度差異很大（圖3），50min后SEDDS膠囊的溶出可達(dá)90%以上，而粉末膠囊從始至終都達(dá)不到10%，兩種制劑在模擬體內(nèi)兩種不同介質(zhì)（0.1mol／L HCl和磷酸鹽緩沖液PBS）中的溶出差異不大.體外累積溶出度實(shí)驗(yàn)表明：HCPT－SEDDS不管在人工胃液還是人工腸液中都能得到很好的溶出釋放，達(dá)到90%以上，遠(yuǎn)優(yōu)于原料藥.

圖3 HCPT自乳化膠囊和粉末的累積溶出曲線(xiàn)圖Fig.3 The stripping curve for HCPT－SEDDS and HCPT powder capsules

粒徑測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4.最優(yōu)處方稀釋200倍后，微乳粒徑為28.42nm，分散系數(shù)為0.085 1，微乳粒徑小且分布均勻，符合微乳的粒徑要求.形成的微乳在透射電鏡下為均勻球狀或橢圓狀液滴，如圖5所示.

圖4 最優(yōu)處方粒徑分布圖Fig.4 The particle size distribution figure of the optimum prescription

2.4.5 初步穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

在室溫留樣條件下放置6個(gè)月，HCPT－SEDDS的外觀仍為均一淡黃色澄清透明溶液，遇水約6min可自乳化形成微乳.形成的微乳半透明帶淡藍(lán)色乳光，離心不分層，粒徑仍在30～50nm之間，1h累積溶出度達(dá)85%以上，藥物含量仍在90%以上，符合制劑要求.結(jié)果表明：HCPT－SEDDS的各項(xiàng)考察指標(biāo)基本上無(wú)顯著變化，說(shuō)明HCPT－SEDDS在6個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定（表4）.

表4 HCPT－SEDDS在六個(gè)月內(nèi)各項(xiàng)理化性質(zhì)的比較Table 4 The comparison of the HCPT－SEDDS physicochemical properties within six months

初步穩(wěn)定性試驗(yàn)表明：羥基喜樹(shù)堿自乳化給藥系統(tǒng)（HCPT－SEDDS）在六個(gè)月內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)異常，但其長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)還需進(jìn)一步考察.

3 結(jié) 論

HCPT是水溶性和脂溶性均不好的抗腫瘤藥物，其在正辛醇／水中分配系數(shù)不大，這個(gè)理化性質(zhì)顯示了其口服吸收受到極大限制.自乳化給藥系統(tǒng)作為一種新型藥物傳遞系統(tǒng)，在提高藥物質(zhì)量濃度、增加藥物穩(wěn)定性、降低藥物毒副作用、緩控釋給藥等方面有著廣泛的應(yīng)用.研究制備的自乳化濃縮液對(duì)羥基喜樹(shù)堿有較大的質(zhì)量濃度，在人工胃腸道消化液環(huán)境下可自發(fā)形成粒徑小于40nm的微乳液，可經(jīng)淋巴管吸收克服首過(guò)效應(yīng)，而且避免了胃腸道內(nèi)酶水解，有助于提高口服生物利用度.而且由于處方中大量的表面活性劑能改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性，提高藥物的膜滲透性，可以大大提高口服生物利用度［9］.此外，羥基喜樹(shù)堿自乳化傳遞系統(tǒng)的體外抗腫瘤細(xì)胞活性及體內(nèi)吸收情況有待于研究，進(jìn)而為其自乳化制劑的開(kāi)發(fā)提供更加詳實(shí)的依據(jù).

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