馬 嵩，王留成

（鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001）

豨薟草中抗糖尿病成分的研究

馬 嵩，王留成

（鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001）

以PTP-1B抑制作用為模型對(duì)豨薟草各分離部位和有效成分進(jìn)行體外篩選，確定了豨薟草降低胰島素抵抗活性成分.通過反復(fù)柱層析得到一個(gè)活性成分經(jīng)紫外、紅外、1H-NMR等波譜分析確定化學(xué)結(jié)構(gòu)為槲皮素，確認(rèn)它即為豨薟草降低胰島素抵抗作用的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ).

豨薟草；蛋白酪氨酸磷酸酶；抑制劑；槲皮素

豨薟草（Herba Siegesbeckiae）為菊科一年生草本植物，主要分布于熱帶和溫帶地區(qū)[1]，全世界共有五種，我國目前有3種.豨薟是臨床常用的中藥，具有祛風(fēng)濕，利筋骨，降血壓等功效.臨床常用于四肢麻痹，筋骨疼痛，腰膝無力，瘧疾，急性肝炎，高血壓病，疔瘡腫毒，外傷出血等疾病的治療.

作為降糖中藥，延邊大學(xué)的李志勇的研究表明，豨薟草的水提物、醇提物均對(duì)鏈脲佐菌素引起的動(dòng)物高血糖有治療作用，能顯著降低模型大鼠胰島素抵抗作用.PTP-1B是1988年被分離的一種蛋白酪氨酸磷酸酶，由于其在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中的負(fù)調(diào)節(jié)作用可導(dǎo)致個(gè)體胰島素抵抗，從而發(fā)生糖脂代謝紊亂，進(jìn)一步形成2型糖尿病.本文以PTP-1B抑制作用為模型對(duì)豨薟草降低胰島素抵抗作用成分進(jìn)行體外篩選.

1 儀器與材料

原料：豨薟草（購于鄭州中藥城）經(jīng)河南省中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院馮衛(wèi)生教授鑒定為中藥豨薟,PTP-1B(自制），薄層硅膠（GF254-R）和柱層析硅膠，青島海洋化工有限公司；對(duì)硝基苯磷酸二鈉（pNPP），美國Amresco公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

儀器：HP.1-26電熱恒溫水浴鍋(北京卓川電子科技有限公司),723可見分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠),TGL-18C高速臺(tái)式離心機(jī) (上海安亨科學(xué)儀器廠)BRUKER紅外光譜儀；Bruker Avance AMX-400核磁公振光譜儀 (美國Bruker公司),Multiscan MK3酶標(biāo)儀(芬蘭).

2 試驗(yàn)方法

2.1 提取、分離與化合物結(jié)構(gòu)鑒定

稱取粉碎的豨薟草粉5kg，用95%乙醇回流提取3次，減壓抽濾回收乙醇后得浸膏.浸膏用水分散后先后用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，蒸去溶劑分別得石油醚，乙酸乙酯，正丁醇組分，計(jì)算收率，不同組分各取20mg用100μL乙醇溶解，酶動(dòng)力學(xué)測(cè)體外抑制作用.

乙酸乙酯組分進(jìn)行硅膠柱層析，取1KG柱層析硅膠，石油醚濕法裝柱，用石油醚：乙酸乙酯=4:1溶解樣品上樣，分別用石油醚：乙酸乙酯=4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，乙酸乙酯：甲醇=20:1、10:1、5:1 洗脫，每管200mL，共接100管，其中Fr18～22得R1＃組分；Fr36～40得 R2＃組分；Fr45～49得 R3＃組分Fr56～61得R4＃組分Fr68～74得R5＃組分.

取200g柱層析硅膠，甲苯濕法裝柱，用甲苯：甲酸乙酯=6：1溶解樣品上樣，分別用甲苯：甲酸乙酯：甲酸=6：1：0.1、5:1:0.1、4:1:0.1、3:1:0.1、2:1:0.1、1:1:0.1、1:2:0.1洗脫，每管50mL，共接70管合并 20～25流份得到淡黃色粉末狀物，經(jīng)吡啶重結(jié)晶，得淡黃色粉末結(jié)晶，即化合物R6＃.合并37～40流份析出透明結(jié)晶，用氯仿重結(jié)晶即得到化合物R7＃.

2.2 酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

表1 樣品抑制活性的反應(yīng)體系

底物濃度26.66mmol/L時(shí)，取一定量的豨薟草各組分提取液，在405nm處測(cè)定其吸光度.試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1（以不加酶的反應(yīng)體系作為對(duì)照）.

3 結(jié)果與分析

3.1 提取

豨薟草提取及各組分收率見表2.

表2 豨薟草提取各組分收率

由表2可知，豨薟草浸膏收率為8.42%，正丁醇組分收率最高，乙酸乙酯次之，石油醚組分最少.

3.2 豨薟草石油醚、乙酸乙酯、正丁醇組分PTP-1B體外抑制活性比較

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇組分對(duì)PTP-1B體外作用的時(shí)間－吸光度曲線結(jié)果見圖1.

圖1 豨薟草各組分的時(shí)間－吸光度曲線

由圖1可知，乙酸乙酯組分的抑制效果最強(qiáng).

3.3 乙酸乙酯相不同組分PTP-1B體外抑制活性比較

乙酸乙酯相經(jīng)反復(fù)柱層析，得到7個(gè)組分，不同組分對(duì)PTP-1B體外作用的時(shí)間－吸光度曲線結(jié)果見圖2.

圖2 純化組分的時(shí)間－吸光度曲線

由 圖 2 可 知 ，R2＃、R2＃、R3＃、R4＃ 和 R5＃ 對(duì)PTP1B的抑制效果不明顯，而R1＃對(duì)PTP1B有明顯的抑制效果，對(duì)R1＃繼續(xù)純化得到R6＃和R7＃.而R6＃抑制效果很好，第20min的吸光度計(jì)算R6＃組分對(duì)PTP1B的抑制率為72.0%.

3.4 化合物R6＃的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色粉末狀固體，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，三氯化鋁反應(yīng)呈黃綠色熒光，α－萘酚試驗(yàn)呈陰性，說明該化合物為不帶糖苷的黃酮類化合物.紅外光譜分析化合物R6＃主要官能團(tuán)紅外吸收歸屬-OH 3346 cm-1;C=O 1670 cm-1;C=C(-Ar)1614、1511、1428 cm-1;-CH3 1363 cm-1;=C-O-C 1311 cm-1;C=O 1211 cm-1以及1H-NMR(3O0MHz，DMSO-d6) δ:12.47 為 5-OH，7.52(IH，d，J=8.5Hz)，6.86(1H，d，J=8.5Hz)，7.65(1H，s)為 B 環(huán) ABX 系統(tǒng)，分別為 B 環(huán) H-5’，H-6’，H-2’.δ:6.16(1H，s)為 H-6，δ:6.38(1H，s)為 H-8，δ:10.68(1H，s，7-OH)，δ:9.36(3H，s，3-OH，3’，4’-OH)與文獻(xiàn)[3]一致確定化合物R3＃為槲皮素.

4 結(jié)論

傳統(tǒng)中藥記載，豨薟對(duì)消渴癥具有一定的療效，已有的研究證明，豨薟提取物能顯著降低模型大鼠胰島素抵抗作用.本文以生物活性為導(dǎo)向，從豨薟中分離得到了優(yōu)良的PTP1B抑制劑槲皮素，該化合物可能是豨薟抗糖尿病的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ).

〔1〕陰健，郭力弓.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用[M].北京：學(xué)苑出版社，1997.

〔2〕北京醫(yī)學(xué)院，北京中醫(yī)學(xué)院.中草藥成分化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1980.

〔3〕TernalB.Tetrahedron,1976,32(5):565.

R285.5

A

1673-260X（2012）06-0045-02