董志芳，劉 嵐

（新疆教育學(xué)院 理學(xué)分院，新疆 烏魯木齊 830017）

rDNA在藻類分類鑒定中的應(yīng)用

董志芳，劉 嵐

（新疆教育學(xué)院 理學(xué)分院，新疆 烏魯木齊 830017）

本文闡述了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法和分子生物學(xué)方法在藻類分類鑒定中的應(yīng)用，以核糖體RNA基因中的18S、26S rDNA及轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）為主，舉例說明了rDNA在藻類分子分類鑒定中的應(yīng)用及其原理.指出只有將形態(tài)學(xué)觀察和分子分類學(xué)方法有機的結(jié)合起來才能快速而準確的對藻類進行分類鑒定.

藻類；分子分類；18S rDNA；26S rDNA；轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）

在資源與環(huán)境等世界性問題日益嚴重的今天，藻類的開發(fā)與應(yīng)用研究具有重要的社會經(jīng)濟價值.然而在藻類的開發(fā)與利用中藻類的鑒定及其分類則是藻類應(yīng)用的前提和基礎(chǔ).藻類的傳統(tǒng)鑒定方法主要是以它的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特點為基礎(chǔ)的自然分類[1].二十世紀八十年代隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，產(chǎn)生了分子分類學(xué).這也為藻類的分子分類鑒定開辟了廣闊的前景.

1 藻類的傳統(tǒng)分類鑒定及其不足

形態(tài)學(xué)觀察鑒定是傳統(tǒng)的藻類分類鑒定方法，其主要根據(jù)藻類細胞的形狀、鞭毛數(shù)目形態(tài)、色素體的多少及其形態(tài)、位置和色素含量的多少以及細胞壁結(jié)構(gòu)等的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征來確定藻的種類[2].但是，由于藻的種類繁多，而且它們的個體微小，加之許多藻種間的差異細微，必須要有豐富經(jīng)驗的藻類專家來進行仔細的鑒別.另外，一些藻類需要根據(jù)他們的生活史進行鑒定，而藻類的生活周期也受到CO2濃度及光照周期等許多環(huán)境因素的控制，需要長時間不間斷觀察，受主觀因素影響較大.由此可見，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法對藻類的鑒定受到諸多因素的影響，結(jié)果缺乏可靠性和標準性，不能方便快捷的對藻類進行鑒定.所以，需要尋求快速而準確的藻類分類鑒定方法.

2 藻類的分子分類學(xué)鑒定

2.1 現(xiàn)代分子分類法概述

現(xiàn)代分子分類方法主要有兩種：分別為蛋白質(zhì)分子標記和DAN分子標記.但是由于蛋白質(zhì)分子標記只能反映基因組編碼區(qū)的表達信息，無法了解非編碼區(qū)的遺傳信息，而且用于分子標記的同工酶數(shù)量也很有限，所以用此法研究某些植物屬、種的分類和鑒定時很難獲得準確的結(jié)果.而以DNA分子標記為基礎(chǔ)的分類方法主要是利用DNA分子特征在基因水平上對物種基因序列的差異進行比較.當前在藻類的分子鑒定中應(yīng)用最廣泛的就是以rDNA分子特征為標記對藻類進行分子水平的分類鑒定.rDNA常被稱為核糖體RNA(rRNA)基因，其實它是指rRNA基因群中的一個重復(fù)單位，包括5.8S、18S和26S rRNA的基因及其與它們相鄰的間隔區(qū)、非轉(zhuǎn)錄區(qū).在每個重復(fù)序列中，這3個基因總是依次首尾相連，它們之間由內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS（internal transcribed spacer）分開 （圖1）.rDNA存在于所有生物的細胞中，其功能同源且最為古老，既含有保守序列又含可變序列，分子大小適合操作；它的序列變化與進化距離相適應(yīng)，是研究生命起源與進化的“活化石”.

2.2 18S和26S rDNA在藻類分子鑒定中的應(yīng)用

在進化過程中，由于rDNA不同區(qū)段所受的選擇壓力不同，所以各區(qū)段的保守性差異明顯，這為研究生物進化關(guān)系帶來了極大的方便，同時也為物種系統(tǒng)發(fā)育分析和分類鑒定提供了合適的標記性序列.18S和26S rRNA基因區(qū)的DNA序列是中度保守的.在藻類的系統(tǒng)發(fā)育和分類分析研究中，18S和26S rDNA也起著較重要的作用.如Thomas Pr?schold等人根據(jù)核糖體小亞基18S序列對衣藻屬、擬衣藻屬和綠梭藻屬的32個種以及綠藻綱的132個種的分類在屬的水平上進行了修改[3].Daugbjerg等通過比對部分大亞基序列，對裸甲藻(Gymnodinium)屬中部分在分類學(xué)中存有爭議的物種重新進行了分類研究，結(jié)果認為，裸甲藻屬目前包含的物種應(yīng)劃分為4個不同的屬[4].但Anderson等人在利用亞歷山大藻屬rDNA探針研究不同藻屬間15種甲藻的分類鑒定時發(fā)現(xiàn)，18S rDNA和28S rDNA只適用于生物不同屬間的分類[5]，Wlicox和Bakker等也都指出 18S rDNA序列不能較好的解決同一屬間不同種的分類問題[6，7].

2.3 ITS在藻類分子鑒定中的應(yīng)用

ITS1和ITS2是進化過程中的較中度保守區(qū)域，其保守性主要表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異比較明顯，作為研究生物各屬下種間水平的一個分子標記，已在許多物種鑒定中得到廣泛應(yīng)用.長期的分子生物學(xué)研究結(jié)果表明：ITS區(qū)序列在被子植物大多數(shù)科屬的種間差異值為1.2-10.2%，屬間差異值達到9.6-28.8%；在真菌和藻類中，ITS種間差異值一般大于14.0%；而在某些單細胞微藻類中，ITS區(qū)序列在種間的差異值可達20%以上[8].由此可見，ITS區(qū)比較適合用于研究真核生物物種的分子分類鑒定以及同一屬內(nèi)不同物種間或者種內(nèi)差異較大的不同種群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.近年來，ITS區(qū)序列在藻類的分類鑒定研究中也發(fā)揮著重要作用.如Adachi等指出，藻類ITS不同種間的遺傳距離值為0.02-0.2[9,10]；張馳、胡鴻鈞等人以ITS分子序列系統(tǒng)發(fā)育分析作為傳統(tǒng)性狀分析的補充研究了15個衣藻種間的親緣關(guān)系[11]；陳月琴等分析12株藻類的ITS序列時發(fā)現(xiàn)不同種間ITS核苷酸序列差異大于0.2，而同一種內(nèi)個體間的ITS核苷酸序列差異僅為0.01，這一研究結(jié)果充分表明ITS序列可作為種間分類鑒定的有利依據(jù)[12].

3 結(jié)語

近年來隨著生物技術(shù)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，藻類分子生物學(xué)信息也在不斷的增多，為PCR擴增片段的序列比對提供了基礎(chǔ)，為藻類的分子分類鑒定提供了有利條件.借助PCR技術(shù)可以方便快捷的擴增rDNA片段，并進行序列測定，之后應(yīng)用BLAST軟件，將測定的rDNA核酸序列在國際核酸數(shù)據(jù)庫GenBank中搜索比對，找出與它同源性較高的匹配序列，最后將待鑒定的藻類劃分到相應(yīng)的屬或者種內(nèi)，或者將測得的核酸序列序與找出的同源性較高的相似性序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，從而更進一步的判斷物種分類屬性.此方法是目前最常用最簡單的分子分類鑒定方法.

在藻類的鑒定過程中，單靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類鑒定是遠遠不夠的，因為形態(tài)上的差異可能是由于基因差異造成的，也可能是由于環(huán)境因素造成的；而且形態(tài)學(xué)鑒定還受到許多人為因素的影響，結(jié)果缺乏可靠性和標準性，所以藻類的鑒定必須將傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定和現(xiàn)代分子分類學(xué)鑒定相結(jié)合.目前利用核糖體RNA基因(rDNA)序列對藻類進行分子水平的分類分析己成為傳統(tǒng)藻類形態(tài)學(xué)鑒定的重要補充手段.只有綜合多方面因素才能快速而準確的對藻類進行分類鑒定.

〔1〕甄毓,于志剛,米鐵柱.分子生物學(xué)在微藻分類研究中的應(yīng)用.中國海洋大學(xué)學(xué)報，2006，36(6)：875—87.

〔2〕胡鴻鈞，李堯英.中國淡水藻類[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1980.

〔3〕Thomas Pr?scholda,Birger Marina,Uwe Gert Schl?sserb,and MichaelMelkoniana.MolecularPhylogeny and Taxonomic Revision of Chlamydomonas(Chlorophyta).I.Emendation of Chlamydomonas Ehrenberg and Chloromonas Gobi,and Description ofOogamochlamys gen.nov.and Lobochlamys gen.nov.1 Protist,(2001)Vol.152,265–300.

〔4〕Daugbjerg N,Hansen G.,Larsen J,Moestrup.Phylogeny of some of the major genera of dinoflagellates based on uhrasrtiwcture and partial LSU rDNA sequence data,including the rection of three new genera of naked dinoflagellate.Phycologia,2000,39:302-317.

〔5〕Anderson DM,Kulis DM,Doucete Gl,Gallagher JC,Balech E.Biogeography of toxic dinoflagellates in the genus Alexandirum from the northeastern United States and Canada.Marine Biology,19 94,12 0:46 7-478.

〔6〕Wilcox TP.Large subunit ribosomal nu t systematics dinoflagellates:morphology does not recapitulate phylogeny.Molecular Phylogenetics and Evolution,1998,10:436-448.

〔7〕Bakker FT,Olsen JL,Stam WT,Van den Hoek C.Nuclear ribosomal DNA internal Transcribed space regions (ITS-1 nd ITS-2)define discrete biogeographic groups in Cladophora albida(Chlorophyta).Journal of Phycology,1992,28:839-845.

〔8〕屈良鵠、陳月琴，1999.生物分子分類檢索表―原理與方法，中山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），38(1):1-6.

〔9〕Adachi M，Sako Y，Ishida Y.Analysis of Gymnodinium catenatum(Dinophyceae)using sequences of the 5 8S rDNA ITS regionsand random amplified polymorphic DNA[J]Fisheries Science(Fokyo)，1997.63：701—707.

〔10〕Antonella P，Magda V，Santiago F，et al.Characterization of Osteropsis and Coolia (Dinophyceae)isolates in the western Mediterranean Sea based on morphology，toxicity and internal transcribed spacer 5.8S rDNA sequences[J].Journal of Phycology，2005，4 1：212 225.

〔11〕張弛,胡鴻鈞,李中奎,李夜光,鐘揚.衣藻屬的系統(tǒng)發(fā)育分析——基于形態(tài)形狀和nrDNAITS序列 武漢植物學(xué)研究,2000，18(3):189～194.

〔12〕陳月琴，屈良鵠.海洋亞歷山大藻屬種間界定的分子標準[J].中山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1999，38(1)：7-11.

Q949.2

A

1673-260X（2012）01-0030-02