徐 娜, 逄少軍

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京100049)

浮游微藻是海洋中最主要的初級生產(chǎn)者, 在海洋生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用。一些微藻能夠引發(fā)赤潮, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖、人類健康和海洋環(huán)境都造成巨大負面影響。很多海洋微藻是水產(chǎn)動物開口餌料, 或者活性物質(zhì)、生物能源等研究的基礎(chǔ)生物材料[1]。微藻的傳統(tǒng)鑒定主要是依靠形態(tài)特征, 但對于一些個體微小或形態(tài)多變的種類, 需借助電子顯微鏡。電鏡觀察受設(shè)備條件的限制, 而且電鏡樣品處理復(fù)雜, 廣泛使用有一定的難度。另外, 在微藻分類中存在很多同物異名的現(xiàn)象, 例如卡羅藻Karlodinium vene fi cum就有Gymnodinium galatheanum,Karlodinium micrum等多個名稱[2-3]。目前的微藻鑒定和命名存在欠缺準(zhǔn)確性、具有主觀性等問題, 在國內(nèi), 不同研究者對一些拉丁文名稱的翻譯也不一致。隨著對生物鑒定研究的深入, 很多物種的命名已發(fā)生改變, 而大多分類參考書目因年代較早而沒有囊括這些更新的物種。分子生物學(xué)方法對藻種的鑒定不受條件及環(huán)境因素限制, 是一種準(zhǔn)確、客觀、高效的方法。Genbank收錄了大量生物分子序列, 而且數(shù)量在不斷快速增加,為研究系統(tǒng)進化及物種鑒定提供了重要參考。核糖體18S rDNA和ITS序列是藻類分子鑒定和分類中最常用的兩個分子指標(biāo)[4]。

在持續(xù)建立我國近海浮游單細胞海藻活體種質(zhì)庫的過程中, 人們需要對其中的一些重要物種建立豐富培養(yǎng)的條件, 同時準(zhǔn)確無誤地完成相關(guān)生物學(xué)鑒定。本文報道了作者通過使用兩種分子標(biāo)記序列對三種新分離的單細胞海藻進行鑒定和培養(yǎng)條件研究的結(jié)果。研究表明這三種藻都是能夠引發(fā)赤潮的海藻物種。研究它們在不同環(huán)境條件下的生長潛力,對揭示其在自然界大規(guī)模暴發(fā)的機制有重要參考意義。本項實驗所采用的使用光密度(optical density)來檢測海藻生物量變化的研究方法在國際上被廣泛采用[5-10]。這種方法是利用微藻在某一波長下的光吸收值來間接評價細胞密度的變化, 并以此作為衡量藻生物量的指標(biāo)。相對于傳統(tǒng)的細胞計數(shù)法, 光密度法具有簡單快速、客觀準(zhǔn)確、不傷害實驗材料等優(yōu)點[11-13]。

1 材料與方法

1.1 藻種的來源及分離方法

藻種Mbccc-Gym-1、HH200907-1和HH200907-2由北黃海水樣中分離得到。采回的水樣加入滅菌海水配制的f/2培養(yǎng)液[14-15](不添加硅酸鹽)進行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為20℃, 以白熾燈為光源, 光照強度為3 000 lx, 光照周期12L : 12D。定期檢查富集培養(yǎng)藻液的細胞密度。約一周后進行藻種分離, 將藻液逐漸稀釋直到一滴(約1μL)平均只含有一個藻細胞, 在顯微鏡下檢查, 把只含一個藻細胞的水滴轉(zhuǎn)移至24孔組織培養(yǎng)板中, 加入f/2培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。得到純的藻種后轉(zhuǎn)移到三角瓶中擴大培養(yǎng)。

1.2 藻種的鑒定

1.2.1 形態(tài)的顯微觀察

取純培養(yǎng)的藻液直接置于倒置顯微鏡下(江南XD-202, 中國)觀察活體藻細胞。另取少量藻液固定后用正置顯微鏡(Nikon E100, 日本)的油鏡觀察并拍照(Canon EOS 1000D, 日本)。掃描電鏡樣品制備:將藻細胞抽濾到濾膜上, 用2.5%戊二醛溶液固定1 h;之后用 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液洗滌 3次; 依次在30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇中各脫水10 min, 100%的乙醇2×10 min; 隨后先用乙醇: 醋酸異戊酯(1 : 1)置換10 min, 再用100%的醋酸異戊酯20 min; 樣品在臨界點干燥并噴金, 用掃描電子顯微鏡(KYKY-2800B, 中國)觀察拍照。

1.2.2 分子鑒定

取50 mL處于對數(shù)生長期的純種藻液, 7 000g離心5 min, 棄上清收集藻細胞。用植物試劑盒提取基因組DNA。

18S rDNA序列的擴增采用真核生物18S通用引物 SSU-F/ SSU-R[16]。擴增藻種 Mbccc-Gym-1和HH200907-1所用的 ITS序列引物為 ITS1/ITS2[4];HH200907-2的ITS序列引物為ITS4/ ITS5[17]。PCR反應(yīng)體積50 μL, 體系包括: 模板基因組DNA 2.5 μL,引物(20 μmol/L)各 1 μL, Taq 酶預(yù)混合的 PCR 反應(yīng)液(Takara, 日本)25 μL, 補充 ddH2O 至 50 μL。18S 序列擴增循環(huán)程序為: 94℃預(yù)變性10min; 之后94℃變性30 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸90s, 循環(huán)32次; 最后 72℃延伸10 min[16]。Mbccc-Gym-1和HH200907-1的 ITS序列擴增程序為: 95℃預(yù)變性 5 min; 之后94℃1 min, 55℃1 min, 72℃2 min, 循環(huán) 30次后 72℃延伸5 min[4]。擴增HH200907-2 ITS序列的程序為95℃預(yù)變性5 min; 之后94℃1 min, 45℃1 min, 72℃1 min, 循環(huán)25次, 最后72℃延伸5 min[17]。

擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收目標(biāo)片段, 連接到 pMD18-T 載體, 并轉(zhuǎn)化感受態(tài)Escherichia coliDH-5α, 用藍白斑法篩選陽性克隆。用菌液 PCR檢測白斑菌落, 重組成功的菌落擴增培養(yǎng)后送至上海博尚測序公司測序。

將測得的序列在NCBI用BLAST進行同源檢測,找出與其最相近的物種。在 Genbank下載相關(guān)物種的18S rDNA序列及ITS序列, 與測得的序列一起用BioEdit軟件的Clustal W[18]進行多序列對位分析。用MEGA 4[19]的 Kimura 2-parameter 模型計算遺傳距離, 采用鄰接法(neighbor-joining/ NJ)[20]構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 用自舉分析(bootstrap)[21]估計系統(tǒng)樹分支節(jié)點的置信度, 自舉數(shù)據(jù)集為1000次。

1.3 培養(yǎng)條件實驗

以藻液在680 nm下的光密度值(A680)為參數(shù)衡量藻體生物量。為檢驗A680與藻密度的相關(guān)性, 分別對三種藻不同密度的藻液進行細胞計數(shù)并測量A680, 計算藻液密度–A680標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)。光密度值由T6紫外分光光度計(普析通用, 中國)測得。藻液初始濃度合適時接種于100 mL三角瓶, 分別進行6組單因素實驗。每組實驗平行重復(fù)3個樣本, 置于人工培養(yǎng)箱(江南, 中國)中培養(yǎng), 每天搖瓶2次。每隔一天測量藻液的A680。

表1列出了 6組實驗的條件。每組實驗只有所列條件不同, 其他條件均一致。在實驗1中, 藻液生長條件為溫度15～28℃, 光照強度5 000 lx, 光照周期為12L : 12D。實驗2中藻液生長條件為溫度22℃,光照強度1 500～10 000 lx, 光照周期12L : 12D。實驗3條件為溫度22℃, 光照強度5 000 lx, 光照周期分別為8L : 16D、12L : 12D和16L : 8D。實驗1～3所用培養(yǎng)液都是標(biāo)準(zhǔn)f/2培養(yǎng)液。實驗4用鹽度為1～36的 f/2培養(yǎng)液。實驗 5培養(yǎng)液中氮(N)濃度為0N～3N, 0N代表培養(yǎng)液不添加氮營養(yǎng)鹽, 1N等于標(biāo)準(zhǔn)f/2培養(yǎng)液中的氮濃度(882 μmol/L), N/2等于其一半的濃度, 2N和3N分別代表標(biāo)準(zhǔn)濃度的2和3倍。實驗6培養(yǎng)液的磷(P-)濃度為0P～3P, 0P代表培養(yǎng)液不添加磷營養(yǎng)鹽, 1P等于標(biāo)準(zhǔn)f/2培養(yǎng)液的磷濃度(36.2 μmol/L), P/2等于其一半的濃度, 2P和3P分別代表標(biāo)準(zhǔn)濃度的2和3倍。在實驗4～6中, 其他培養(yǎng)條件為溫度20℃, 光照強度5 000 lx, 光照周期12L : 12D。

表1 6組培養(yǎng)條件實驗Tab. 1 Information of 6 batch culture experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特點

2.1.1 Mbccc-Gym-1

生長狀態(tài)良好的藻液呈黃褐色。在顯微鏡下觀察, 藻細胞橫溝明顯, 將細胞分為大小不等的上下兩部分(圖1a, b)。細胞旋轉(zhuǎn)運動, 活躍的游動細胞長8～15 μm, 寬 5～12 μm, 鞭毛 2 條。細胞易變形, 藻液中加入固定液后細胞很快變成球形。

圖1 Mbccc-Gym-1的形態(tài)特征Fig. 1 Morphological features of strain Mbccc-Gym-1

2.1.2 HH200907-1

藻液黃褐色。藻細胞梨形, 被橫溝分為上下兩部分, 上錐部尖, 下錐部半球形。細胞長 15～30 μm,寬13～25 μm(圖2a)。細胞前端伸出兩條不等長的鞭毛。掃描電鏡照片可看到明顯的橫溝和縱溝(圖2b)。藻體細胞在營養(yǎng)匱乏或條件不適宜時, 會形成孢囊。孢囊個體較大, 近球形, 表面具尖刺狀或不規(guī)則的突起(圖 2c)。

2.1.3 HH200907-2

藻液呈黃褐色至褐色。藻細胞一般為橢圓形, 長13～20 μm, 寬 7～13 μm(圖 3a,b)。細胞一側(cè)近體長1/3處有一短凹陷, 此處伸出兩條不等長的鞭毛。細胞核明顯。無細胞壁, 細胞形狀易變化。當(dāng)藻體被轉(zhuǎn)移至淡水中或加入固定液后, 細胞膜很快破裂, 可明顯看到十幾個黃綠色的葉綠體(圖3c)。

2.2 分子鑒定: 18S rDNA及ITS序列分析

2.2.1 Mbccc-Gym-1

Mbccc-Gym-1的18S rDNA去除引物后序列長度為 1742 bp, 提交至 Genbank獲得序列號JQ320136。ITS序列去除引物后長度為 613bp(Genbank索引號: JQ320137)。兩條序列分別經(jīng)BLASTn進行在線檢索, 與之相似性得分最高的物種都是共生甲藻屬(Symbiodinium)。將18S rDNA序列與Genbank中的相似序列用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹(圖 4)表明, Mbccc-Gym-1和幾株Symbiodiniumsp.、S. microadriaticum、S. californium、Dinophyceae sp. CCMP421(實為共生甲藻屬[22])完全聚在一起, 支持率為 100%。依據(jù) ITS序列構(gòu)建的進化樹(圖 5)結(jié)果相似, Mbccc-Gym-1與幾株共生甲藻Symbiodiniumsp.、S. microadriaticum、S. californium和裸甲藻Gymnodiniumsp.聚為單獨的一支, 支持率為100%。經(jīng)查閱, Genbank收錄的這幾株裸甲藻Gymnodiniumsp.實際也都為共生甲藻。因此, 根據(jù)這兩條序列的分析結(jié)果, 這株藻應(yīng)該為共生甲藻屬, 但是由于該屬內(nèi)種間差異較小, 這兩種序列都不能很好地區(qū)分開不同種, 且 Genbank中與這株藻相近的生物大多未定名到種, 故暫不能對 Mbccc-Gym-1的種名作出判斷, 只推斷為一種可以獨立生活的共生甲藻Symbiodiniumsp.。

圖2 HH200907-1的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological features of strain HH200907-1

圖3 HH200907-2的形態(tài)特征Fig. 3 Morphological features of strain HH200907-2

圖4 依據(jù)18S rDNA序列通過鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(重復(fù)1000次計算bootstrap值), 以Alexandrium tamarense為外類群Fig. 4 The neighbor-joining tree of 18S rDNA sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node. Alexandrium tamarense is used as outgroup

圖5 依據(jù)ITS序列通過鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(重復(fù)1000次計算bootstrap值), 以Alexandrium tamarense為外類群Fig. 5 The neighbor-joining tree of ITS sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node.Alexandrium tamarense is used as outgroup

2.2.2 HH200907-1

HH200907-1的18S rDNA序列去引物后長度為1744bp, 提交至Genbank獲得序列號JQ246506。ITS序列去除引物后長度為 601bp, Genbank序列號JQ250798。將兩個序列經(jīng)BLASTn進行在線檢索, 都與Scrippsiella trochoidea(錐狀斯氏藻)相似性得分最高。依據(jù)18S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)樹(圖 6)表明, 該藻與Genbank收錄的幾株S. trochoidea聚在一起, 支持率 85%。ITS序列系統(tǒng)樹(圖 7)中, 幾株S. trochoidea沒有形成單獨的一支, 有一定的種內(nèi)差異, 但HH200907-1與大多數(shù)的S. trochoidea聚在一起。因此,作者認(rèn)為這株藻應(yīng)該是錐狀斯氏藻S. trochoidea。

圖6 依據(jù)18S rDNA序列通過鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(重復(fù)1000次計算bootstrap值), 以Alexandrium tamarense(塔瑪亞歷山大藻)為外類群Fig. 6 The neighbor-joining tree of 18S rDNA sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node. Alexandrium tamarense is used as outgroup

圖7 依據(jù)ITS序列通過鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(重復(fù)1000次計算bootstrap值), 以Alexandrium tamarense為外類群Fig. 7 The neighbor-joining tree of ITS sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node.Alexandrium tamarense is used as outgroup

2.2.3 HH200907-2

HH200907-2的18S rDNA序列去除引物后長度為1751bp, Genbank序列索引號JQ250796。ITS序列去引物長度為610bp, Genbank序列號JQ250797。將兩個序列經(jīng) BLASTn進行在線檢索, 都與Heterosigma akashiwo(赤潮異彎藻)相似性得分最高。依據(jù) 18S rDNA 構(gòu)建的系統(tǒng)樹(圖 8)表明, 該藻與Genbank收錄的幾株H. akashiwo聚在一起, 支持率100%。ITS序列系統(tǒng)樹(圖9)中, HH200907-2同樣以100%的支持率與H. akashiwo聚為一支。因此, 作者推斷這株藻應(yīng)該為赤潮異彎藻H. akashiwo。

2.3 三種藻的生長條件

2.3.1A680-細胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線

三種藻的A680-細胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 10)相關(guān)系數(shù)(R2)都大于0.99。作者檢驗了三種藻在不同培養(yǎng)條件下的細胞密度和A680值, 與標(biāo)準(zhǔn)曲線吻合良好, 表明在680nm測得的三種藻的A值都可以用來代表細胞密度。

2.3.2 共生甲藻

圖11a表明, 共生甲藻在19～28℃生長良好, 在15℃低溫時生長較緩慢; 低光照強度時(1 500 lx)生長受限, 4000～10 000 lx條件下, 其生長速度接近(圖 11b); 延長光照時間能促進其生長, 但影響不大(圖 11c); 淡水中藻體無法存活, 在低鹽度(15)中生長也受限制, 在鹽度大于20的培養(yǎng)液中生長無顯著差異(圖 11d); 培養(yǎng)液中氮濃度對其生長影響較大,不額外添加氮營養(yǎng)鹽時, 藻體繁殖受限, 氮濃度越高, 藻密度越高(圖 11e); 培養(yǎng)液中低磷濃度也影響其生長, 但磷濃度高于1P(36.2 μmol/L)時, 生物量增長一致(圖11f)。

2.3.3 錐狀斯氏藻

錐狀斯氏藻在 28℃高溫時生長受到限制, 19～22℃生長最好(圖12a); 1 500 lx的低光照強度限制其生長, 在4 000 lx的光照下開始生長雖較慢, 但最終能達到較高的生物量(圖 12b); 短的光照時間(8L:16D)下, 藻體密度開始上升較慢, 但最終生物量最高, 長光照時間下的藻體最初生長最快, 但最早進入穩(wěn)定生長期(圖 12c); 圖 12d表明藻體在淡水中無法存活, 鹽度為15～25時生長最好; 圖12e中, 低氮濃度的培養(yǎng)液不利于藻體的生長, 在氮濃度為 2N(1 764 μmol/L)和 3N(2 646 μmol/L)時, 最終獲得的生物量最大; 培養(yǎng)液不添加磷營養(yǎng)鹽可維持藻體緩慢增長, 磷濃度高于 P/2(即 18.1 μmol/L)時, 對其生長影響差別不大(圖12f)。

圖8 依據(jù)18S rDNA序列通過鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(重復(fù)1000次計算bootstrap值), 以Fibrocapsa japonica為外類群Fig. 8 The neighbor-joining tree of 18S rDNA sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node. Fibrocapsa japonica is used as outgroup

圖9 依據(jù)ITS序列通過鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(重復(fù)1000次計算bootstrap值), 以Fibrocapsa japonica為外類群Fig. 9 The neighbor-joining tree of ITS sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node.Fibrocapsa japonica is used as outgroup

圖10 三種藻的A680-細胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 10 The relationship between A680and cell density of three microalgae

圖11 共生甲藻在不同溫度(a)、光照強度(b)、光周期(c)、培養(yǎng)液鹽度(d)、氮濃度(e)、磷濃度(f)下的生長曲線Fig. 11 Increases of algal biomass of Symbiodinium sp. as determined by A values at different temperatures (a), under different light intensities (b), in different photoperiods (c), in mediums with varied salinities (d), nitrogen (e)and phosphorus (f)levels. Vertical bars represent standard deviations.

圖12 錐狀斯氏藻在不同溫度(a)、光照強度(b)、光周期(c)、培養(yǎng)液鹽度(d)、氮濃度(e)、磷濃度(f)下的生長曲線Fig. 12 Increases of algal biomass of Scrippsiella trochoidea as determined by A values at different temperatures (a), under different light intensities (b), in different photoperiods (c), in mediums with varied salinities (d), nitrogen (e)and phosphorus (f)levels. Vertical bars represent standard deviations

2.3.4 赤潮異彎藻

該藻在不同溫度下生長趨勢一致, 最適溫度為22℃, 低溫(15℃)和高溫(28℃)條件下生長稍差(圖 13a);光照強度較低(1 500 lx)時, 藻體生長明顯受限, 光強高于4 000 lx對其影響不明顯(圖13b); 不同的光周期對它的生長稍有影響, 適當(dāng)延長光照時間能增大生物量(圖13c); 在淡水中該藻不能存活, 鹽度為15～36的培養(yǎng)液對其生長沒有明顯影響(圖 13d); 未添加氮營養(yǎng)鹽的培養(yǎng)液中, 藻體生長受限, 氮濃度高于 1N(即 882 μmol/L)時, 生長狀況一致, 生物量最高(圖 13e); 培養(yǎng)液不添加磷營養(yǎng)鹽也限制藻的生長, P/2(18.1 μmol/L)的磷濃度足夠滿足其快速生長需求(圖13f)。

圖13 赤潮異彎藻在不同溫度(a)、光照強度(b)、光周期(c)、培養(yǎng)液鹽度(d)、氮濃度(e)、磷濃度(f)下的生長曲線Fig.13 Increases of algal biomass of Heterosigma akashiwo as determined by A values at different temperatures (a), under different light intensities (b), in different photoperiods (c), in mediums with varied salinities (d), nitrogen (e)and phosphorus (f)levels. Vertical bars represent standard deviations

3 討論

3.1 對三種藻的分子生物學(xué)鑒定方法

本文所研究的這三種藻在形態(tài)上都有其特殊性,非專業(yè)的研究人員對它們的鑒定有一定困難。分子鑒定作為形態(tài)學(xué)方法的有效補充, 在研究中發(fā)揮越來越重要的作用。近兩年作者通過18S rDNA和ITS兩種序列對新分離微藻進行了分析, 結(jié)果表明這兩種序列的結(jié)合能夠有效鑒定多數(shù)微藻物種。18S rDNA序列相對保守, 對屬以上水平的鑒定較為有效;而 ITS區(qū)變異較大, 更適合于作為種水平的分類依據(jù)[4,23]。

在實驗室長期獨立培養(yǎng)條件下藻種Mbccc-Gym-1生長良好, 它在形態(tài)上與裸甲藻非常相似, 因此最初被鑒定為裸甲藻(Gymnodiniumsp.)。但是在依據(jù)兩種DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中, 它都與Genbank中的共生甲藻屬(Symbiodinium)聚在一起, 而與裸甲藻屬(Gymnodinium)遺傳距離相對較遠。自然界中共生甲藻大多與海洋無脊椎動物共生,但有少數(shù)能自由生活[24]。本株藻雖與裸甲藻形態(tài)相似并獨立生活, 但是作者依據(jù)分子序列分析判斷其應(yīng)為一種能自由生活的共生甲藻(Symbiodiniumsp.)。Wilcox[25]認(rèn)為在共生甲藻中形態(tài)學(xué)特征不能概括系統(tǒng)進化關(guān)系, 他根據(jù) SSU rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中, 有兩種自由生活的甲藻出現(xiàn)在共生甲藻類群中,表明這個類群在進化中曾失去其共生的生活方式。美國國家海洋藻種保藏中心的一株能自由生活的藻種 CCMP421最初被鑒定為裸甲藻(Gymnodinium varians), 但是后來 rDNA分子進化研究表明這株藻應(yīng)該為共生甲藻屬(Symbiodinium), 自由生活的共生甲藻可能代表共生甲藻屬中的一個亞屬[26]。研究者對水體中分離得到的自由生活的共生藻有不同看法,有人認(rèn)為是底棲共生藻遷移到水體尋找新的宿主,也有人認(rèn)為它們不能共生只能自由生活[27-29]。陳國福等[24]認(rèn)為這種藻有引發(fā)赤潮的可能。

錐狀斯氏藻(S. trochoidea)是一種常見的世界廣布性赤潮藻, 由其引發(fā)的赤潮在挪威、美國、智利、羅馬尼亞、日本等國家都有過報道, 也是我國沿海特別是南海海域常見優(yōu)勢甲藻[30]。錐狀斯氏藻在其生活史的某一時期, 能夠形成孢囊來抵御不良環(huán)境。孢囊也被普遍認(rèn)為是赤潮發(fā)生的“種源”, 對赤潮的發(fā)生、延續(xù)和消亡過程有著重要的作用[31]。孢囊形態(tài)多樣, 王艷等[32]觀察到錐狀斯氏藻可形成 4種形態(tài)的休眠孢囊, 并且與營養(yǎng)細胞形態(tài)差別較大。因此在對錐狀斯氏藻尤其孢囊形態(tài)的藻體鑒定時, 經(jīng)驗不足的工作人員僅僅依靠形態(tài)觀察往往不能夠完成準(zhǔn)確鑒定, 而分子鑒定可排除這種影響。

赤潮異彎藻(H. akashiwo)也是一種常見的赤潮藻, 能夠產(chǎn)生毒素, 在很多國家曾大量暴發(fā)并導(dǎo)致魚類大量死亡[33]。由于培養(yǎng)條件或細胞周期的不同,細胞可呈現(xiàn)球形、卵形或橢圓形等多種形態(tài)[34]。另一方面, 赤潮異彎藻沒有細胞壁, 細胞維持其滲透壓的能力較差, 因此在對其進行形態(tài)觀察時, 細胞經(jīng)常因固定而破裂或變形[35]。作者也在研究中發(fā)現(xiàn),藻樣中加入微量固定液后, 細胞游動減慢并停止,一旦停止游動, 細胞膜便開始破裂, 只有在細胞剛停止游動但細胞膜暫未破裂的半分鐘內(nèi)才能抓拍到其完整形態(tài)的照片, 而想要得到細胞完整形態(tài)的電鏡照片則更加困難。在國內(nèi)外研究中, 這種藻經(jīng)常被誤認(rèn)為是金色滑盤藻(Olisthodiscus luteus)[36]。對這種形態(tài)容易變化的微藻, 依靠分子生物學(xué)方法對其鑒定, 可得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)論。

3.2 培養(yǎng)條件對三種藻的影響

對三種藻的培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn): (1)三種藻都在 22℃的條件下生長最好, 大多數(shù)浮游微藻生長的最適溫度都在 22℃左右[37-40], 并且在我國赤潮頻發(fā)時段為5～8月[41], 20℃左右的水溫也最利于赤潮藻類的大量繁殖; 高溫和低溫對三種藻的影響不同: 共生甲藻不耐低溫, 錐狀斯氏藻在高溫下生長受限, 赤潮異彎藻適溫范圍較廣。(2)光照對它們影響相似, 三種藻在弱光時生長都受限, 大于4 000 lx的光照強度是它們快速增長的必要條件, 不同的是共生甲藻和赤潮異彎藻在光照越強時生長越好, 而錐狀斯氏藻在強光下最初幾天生長最快但第五天開始生物量明顯下降; 延長光照時間對藻體生長繁殖起促進作用,但錐狀斯氏藻在短光照時間下雖最初生長緩慢, 但最終生物量最高。(3)三種藻在鹽度大于15的海水中都能存活, 適鹽范圍都較廣, 在自然界中沿海淡水流入或降雨而導(dǎo)致的海水鹽度的微量變化不會影響它們的生長, 因而赤潮可在近岸暴發(fā)。(4)海水中氮磷濃度對三種藻的生長都有重要的影響, 表現(xiàn)在低濃度限制生長, 高濃度促進生長, 但高到一定程度后, 氮磷濃度的增加不會再對藻生物量的增加產(chǎn)生影響, 用f/2培養(yǎng)液可基本滿足藻體快速生長的氮磷需求。在室內(nèi)對大多數(shù)浮游微藻的常規(guī)培養(yǎng)可采用溫度20～22℃, 10 000 lx光照12h的條件, 用f/2培養(yǎng)液培養(yǎng)。

本研究對三種藻培養(yǎng)的實驗周期為10～12d, 一直持續(xù)到藻體生長的平穩(wěn)期或衰退期。在研究中發(fā)現(xiàn)某些條件下微藻雖在指數(shù)期生長最快, 但是最早進入穩(wěn)定期, 最終生物量可能低于其他條件下的樣品, 因此在微藻培養(yǎng)中應(yīng)根據(jù)實際需要提供最合適的條件。例如對于錐狀斯氏藻, 若要獲得高生物量,在連續(xù)培養(yǎng)時應(yīng)當(dāng)提供高光和長時間光照; 在一次性培養(yǎng)時, 光照強度和時間可適當(dāng)減弱。

[1]鄒樹平, 吳玉龍, 楊明德, 等. 微藻的綜合開發(fā)利用[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2007, 26(3): 179-181.

[2]Bergholtz T, Daugbjerg N, Moestrup ?, et al. On the identity ofKarlodinium veneficumand description ofKarlodinium armigersp. nov. (Dinophyceae), based on light and electron microscopy, nuclear-encoded LSU rDNA, and pigment composition [J].J Phycol, 2005, 42:170-193.

[3]Daugbjerg N, Hansen G, Larsen J, et al. Phylogeny of some of the major genera of dinoflagellates based on ultrastructure and partial LSU rDNA sequence data, including the erection of three new genera of unarmoured dinoflagellates [J].Phycologia, 2000, 39 (4): 302-317.

[4]羅立明, 胡鴻鈞, 李夜光, 等. 東海原甲藻的分子鑒定[J]. 海洋學(xué)報, 2006, 28(1): 127-131.

[5]Tang J X, Hoagland K D, Siegfried B D. Differential toxicity of atrazine to selected freshwater algae[J]. Bull Environ Contam Toxicol, 1997, 59: 631-637.

[6]Ma J, Lin F, Zhang R, et al. Differential sensitivity of two green algae,Scenedesmus quadricaudaandChlorella vulgaris, to 14 pesticide adjuvants[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2004, 58: 61-67.

[7]Liang W Y, Qu J H, Chen L B, et al. Inactivation ofMicrocystis aeruginosaby continuous electrochemical cycling process in tube using Ti/RuO2electrodes[J].Environ Sci Technol, 2005, 39: 4633-4639.

[8]Danger M, Leflaive J, Oumarou C, et al. Control of phytoplankton bacteria interactions by stoichiometric constraints[J]. Oikos, 2007, 116: 1079-1086.

[9]Danger M, Oumarou C, Benest D, et al. Bacteria can control stoichiometry and nutrient limitation of phytoplankton[J]. Functional Ecology, 2007, 21: 202-210.

[10]Chen M, Tang H, Ma H, et al. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algaeDunaliella tertiolecta[J]. Bioresource Technology, 2011,102: 1649-1655.

[11]Persoone G. Development and fi rst validation of a“stock-culture free” algal microbiotest: The Algaltoxkit[C]//Wells P G, Lee K, Blaise C. Microscale aquatic toxicology, advances, techniques and practice.USA: CRC Press, 1998: 311-320.

[12]沈萍萍, 王朝暉, 齊雨藻, 等. 光密度法測定微藻生物量[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版), 2001,22(3): 115-119.

[13]黃美玲, 何慶, 黃建榮, 等. 小球藻生物量的快速測定技術(shù)研究[J]. 河北漁業(yè), 2010, 4: 1-3.

[14]Guillard R R L, Ryther J H. Studies of marine planktonic diatoms. I.Cyclotella nanaHustedt andDetonula confervaceaCleve[J]. Canadian Journal of Microbiology, 1962, 8(2): 229-239.

[15]Guillard R R L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates[C]//Smith W L, Chanley M H.Culture of Marine Invertebrate Animals. New York:Plenum Press, 1975: 26-60.

[16]王波, 米鐵柱, 呂頌輝, 等. 五種/株原甲藻核糖體小亞基(18S rRNA)基因克隆及序列分析[J]. 海洋與湖沼, 2006, 37(5): 450-456.

[17]Connell L B. Nuclear ITS region of the algaHeterosigma akashiwo(Chromophyta: Raphidophyceae)is identical in isolates from Atlantic and Pacific basins[J].Marine Biology, 2000, 136(6): 953-960.

[18]Thompson J D, Higgins D G and Gibson T J. CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice[J]. Nucleic Acids Research, 1994, 22(22): 4673-4680.

[19]Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007,24(8): 1596-1599.

[20]Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406-425.

[21]Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap[J]. Evolution, 1985, 39:783-791.

[22]茍萬里, 劉東艷, 甄毓, 等. 利用 rDNA和 ITS序列對 1株裸甲藻的初步鑒定[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報,2004, 34(1): 75-83.

[23]鄭俊斌, 張鳳英, 馬凌波, 等. 米氏凱倫藻18S rDNA和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 2009,18(6): 680-685.

[24]陳國福, 王廣策, 張春云, 等. 一株裸甲藻類似種的形態(tài)和系統(tǒng)進化分析[J]. 科學(xué)通報, 2008, 53(3):299-305.

[25]Wilcox T P. Large-subunit ribosomal RNA systematics of symbiotic dinoflagellates: morphology does not recapitulate phylogeny[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1998, 10(3): 436-448.

[26]Pochon X, Montoya-Burgos J I, Stadelmann B, et al.Molecular phylogeny, evolutionary rates, and divergence timing of the symbiotic dinoflagellate genusSymbiodinium[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2006, 38(1): 20-30.

[27]Coffroth M A, Lewis C F, Santos S R, et al. Environmental populations of symbiotic dinoflagellates in the genusSymbiodiniumcan initiate symbioses with reef cni-darians[J]. Current Biology, 2006, 16(23): 985-987.

[28]Littman R A, van Oppen M J H, Willis B L. Methods for sampling free-livingSymbiodinium(zooxanthellae)and their distribution and abundance at Lizard Island(Great Barrier Reef)[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2008, 364(1): 48-53.

[29]朱霞, 甄毓, 于志剛. 一株分離自膠州灣的裸甲藻形態(tài)相似種的分子系統(tǒng)學(xué)研究[J]. 海洋學(xué)報, 2011,33(1): 153-162.

[30]張玉娟, 曹宇, 王朝暉, 等. N 和 P對錐狀斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)生長及孢囊形成的影響[J].海洋環(huán)境科學(xué), 2006, 25(4): 7-10.

[31]黃海燕, 陸斗定. 甲藻孢囊研究進展[J]. 海洋學(xué)研究,2009, 27(3): 85-92.

[32]王艷, 熊德甫, 顧海峰, 等. 錐狀施克里普藻孢囊的多種形態(tài)特征[J]. 植物學(xué)報, 2009, 44(6): 701-709.

[33]O’Halloran C, Silver M W, Holman T R, et al.Heterosigma akashiwoin central California waters[J].Harmful Algae, 2006, 5(2): 124-132.

[34]Hara Y and Chihara M. Morphology, ultrastructure and taxonomy of the Raphidophycean algaHeterosigmaakashiwo[J]. Journal of Plant Research, 1987, 100(2):151-163.

[35]周成旭, 汪飛雄, 嚴(yán)小軍. 溫度鹽度和光照條件對赤潮異彎藻細胞穩(wěn)定性的影響[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2008,27(1): 17-19.

[36]顏天, 周名江, 錢培元. 赤潮異彎藻Heterosigma akashiwo的生長特性[J]. 海洋與湖沼, 2002, 33(2):209-214.

[37]馬志珍, 張繼紅. 新分離出的5種微藻的適宜生長溫度試驗[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 1998, 17(2): 26-29.

[38]華雪銘, 周洪琪, 丁卓平. 溫度和光照對微藻的生長,總脂肪含量及脂肪酸組成的影響[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 1999, 8(4): 309-315.

[39]王正方, 張慶, 呂海燕. 溫度、鹽度、光照強度和pH對海洋原甲藻增長的效應(yīng)[J]. 海洋與湖沼, 2001,32(1): 15-18.

[40]陳炳章, 王宗靈, 朱明遠, 等. 溫度、鹽度對具齒原甲藻生長的影響及其與中肋骨條藻的比較[J]. 海洋科學(xué)進展, 2005, 23(1): 60-64.

[41]國家海洋局. 2009年中國海洋環(huán)境質(zhì)量公報[M]. 北京: 海海洋出版社, 2010.