劉夢(mèng)俠, 王麗娟, 孔令怡, 劉洪軍, 吳志昊, 辛夢(mèng)嬌, 張 偉, 尤 鋒

(1. 山東海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002; 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003)

孔鰩(Raja porosa), 俗稱(chēng)勞板魚(yú)、勞子, 隸屬于軟骨魚(yú)綱(Chondrichthyes)、鰩形目(Rajiformes)、鰩科(Rajidae)、鰩屬(Raja), 主要分布于我國(guó)的黃海和東海, 為冷溫性近海底棲魚(yú)類(lèi)[1-2]。該魚(yú)無(wú)硬骨, 肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美, 深受消費(fèi)者青睞, 是一種重要的地方性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。近年來(lái), 由于硬骨魚(yú)資源的衰減和對(duì)軟骨魚(yú)肉、軟骨、魚(yú)鰭需求量的增加, 全球?qū)浌囚~(yú)類(lèi)的捕撈量急增[3], 我國(guó)的孔鰩資源也因受過(guò)度捕撈、海洋環(huán)境污染等因素影響, 導(dǎo)致其資源衰退[4]。遺傳多樣性是生物進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ), 是種質(zhì)資源有效保護(hù)的前提。海洋生物的遺傳結(jié)構(gòu)受到很多海洋因素和生物因素的影響[5], 了解遺傳結(jié)構(gòu)可為物種的種質(zhì)資源檢測(cè)和恢復(fù)提供基本信息,對(duì)于魚(yú)類(lèi)的可持續(xù)管理是十分重要的[6]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)孔鰩的研究相對(duì)較少, 主要集中在攝食[7]、養(yǎng)殖與捕撈[4,8]、物種鑒定[9-10]、繁殖[11]及硫酸軟骨素提取[12]等。

線粒體 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)具有母系遺傳、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、幾乎不發(fā)生重組等特點(diǎn)[13], 其中細(xì)胞色素b基因(cytochromeb,cytb)由于研究背景清晰, 進(jìn)化速度適中, 適合群體水平差異的檢驗(yàn), 經(jīng)常被用于遺傳多樣性研究, 在魚(yú)類(lèi)種群結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)揮了積極作用。目前, 已經(jīng)利用cytb部分序列對(duì)多種軟骨魚(yú)類(lèi)包括多種鯊魚(yú)和鰩科魚(yú)類(lèi)進(jìn)行了群體遺傳多樣性研究[14-19], 但有關(guān)孔鰩群體的研究報(bào)道尚未見(jiàn)到。

本文對(duì) 2009年和 2011年采自榮成灣的孔鰩群體進(jìn)行cytb部分序列的測(cè)定, 分析了其群體遺傳多樣性水平, 并比較了兩個(gè)年度群體遺傳差異, 以期了解榮成灣孔鰩的群體遺傳結(jié)構(gòu)、不同年度間的遺傳分化程度, 為孔鰩資源的開(kāi)發(fā)利用和管理保護(hù)提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)用孔鰩為2009年2～11月、2011年2～8月間分別以底拖網(wǎng)方式采自榮成灣海域(122°37′29″～122°46′16″E, 37°20′38″～37°13′26″N), 各為 10尾(編號(hào)為 RCRP0901-10)和 44尾(編號(hào)為RCRP1101-44)。經(jīng)過(guò)形態(tài)鑒定以后, 取樣品背部肌肉置于–20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取與PCR擴(kuò)增

取孔鰩肌肉組織約 30 mg, 使用海洋動(dòng)物組織基因組提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取基因組 DNA, 操作步驟按照使用說(shuō)明進(jìn)行。參考GenBank上孔鰩線粒體全基因組序列(AY525783.1),設(shè)計(jì)一對(duì)引物cytbF: 5'-TCATCCGCAACATTCACGCCAAT-3',cytbR: 5'-GGCAAGTGGGAGAAGGGTGAGA-3', 擴(kuò)增孔鰩cytb部分序列。PCR反應(yīng)總體積 50 μL, 包括: 2× ES PCR master mix 25 μL(康為世紀(jì)生物科技有限公司), 引物(10 μmol/L)各 2 μL, 基因組DNA 50 ng, 補(bǔ)足滅菌雙蒸水至終體積50 μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性40 s, 58℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 共35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 用膠回收試劑盒(Omega Bio-Tek)對(duì)目的片段回收純化,然后送至上海桑尼生物科技有限公司利用 ABI3730 DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 DNA序列的數(shù)據(jù)處理

54個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果用BioEdit軟件進(jìn)行剪切、拼接和序列核對(duì), 并輔以人工校對(duì)。采用MEGA5.05軟件包計(jì)算群體相應(yīng)序列的堿基組成及2009年, 2011年度樣品間的遺傳距離, 構(gòu)建基于 Kimura-2參數(shù)模型的單倍型鄰接(Neighbor-Joining, NJ)樹(shù), 以Bootstrap 1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)分支置信度。用DnaSP5.10軟件計(jì)算群體單倍型多樣性指數(shù)(H)、核苷酸多態(tài)性指數(shù)(π)、平均核苷酸差異數(shù)(K)以及群體間遺傳分化系數(shù)(Fst), 繪制單倍型的歧點(diǎn)分布。用Arlequin3.5軟件包計(jì)算Tajima’s D和Fu's Fs值, 進(jìn)行中性檢驗(yàn), 以檢驗(yàn)榮成灣孔鰩cytb這段序列是否符合中性變異, 并根據(jù) pairwise difference模型, 進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)。用Network4.0構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 孔鰩的cytb部分序列的特征

經(jīng)比對(duì)校正后獲得了54尾孔鰩的長(zhǎng)度為782bp的cytb基因序列, 未發(fā)現(xiàn)堿基的插入與缺失, 堿基T, C, A, G平均含量分別為0.275±0.105, 0.325±0.098,0.265±0.061, 0.135±0.054, 其中 A+T(54%)平均含量略大于G+C(46%), 與其他硬骨魚(yú)類(lèi)相似[20]。序列中共出現(xiàn)11個(gè)單倍型, 檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)15個(gè), 占核苷酸總數(shù)的1.92%, 簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)6個(gè), 單一變異位點(diǎn)9個(gè)。序列中發(fā)生轉(zhuǎn)換14次, 顛換1次, 轉(zhuǎn)換明顯高于顛換, 轉(zhuǎn)換與顛換的比值遠(yuǎn)高于 Li[21]所提出的期望值 0.5, 表明此片段沒(méi)有飽和, 適合進(jìn)行遺傳變異分析。其中, 2009年群體序列中共出現(xiàn)3個(gè)單倍型,檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)4個(gè), 全部為單一變異位點(diǎn); 2011年群體序列中出現(xiàn)9個(gè)單倍型, 檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)12個(gè),包括簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)6個(gè), 單一變異位點(diǎn)6個(gè)。

在檢測(cè)到的11個(gè)單倍型中, Hap1在2個(gè)年度中均有出現(xiàn), 為共享單倍型, 其頻率也最高, 為70.4%, 其他單倍型則僅在1個(gè)年度出現(xiàn), 在獨(dú)享單倍型中, 除Hap5、Hap7外, 其余單倍型均只檢出一次(表 1)。

表1 榮成灣2009年和2011年孔鰩群體線粒體cytb基因單倍型分布Tab. 1 The cytb haplotype distribution in 2009 and 2011 Raja porosa groups in the Rongcheng Bay

2.2 榮成灣孔鰩群體的系統(tǒng)發(fā)育與遺傳分化

榮成灣孔鰩群體的單倍型數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性指數(shù)見(jiàn)表 2。其單倍型多樣性指數(shù)為0.498, 核苷酸多樣性指數(shù)為0.0018。2009年孔鰩群體單倍型多樣性指數(shù)為0.378, 2011年群體較2009年略高, 為0.532。2個(gè)年度核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.0010和0.0020, 也是2011年的略高于2009年的。

表2 榮成灣2009, 2011年孔鰩群體cytb基因部分序列的遺傳多樣性指數(shù)Tab. 2 Genetic diversity parameters of partial cytb gene sequences of R. porosa groups in the Rongcheng Bay in 2009 and 2011

2009年和 2011年孔鰩群體內(nèi)的 K2p (Kimura 2-parameter)遺傳距離分別為 0.0015和 0.0013, 而 2個(gè)年度群體間的遺傳距離則為0.0013,Fst為0.01778,表明 2個(gè)年度群體間無(wú)顯著遺傳分化。榮成灣孔鰩群體年度間和年度內(nèi)的 AMOVA結(jié)果顯示, 遺傳變異主要集中在相同年度內(nèi)的個(gè)體間, 占 98.22%, 年度間變異僅占1.78%, 年度內(nèi)變異大于年度間變異。2009年和 2011年群體并不存在顯著的遺傳結(jié)構(gòu)差異。

使用K2p模型構(gòu)建的11種單倍型的鄰接系統(tǒng)樹(shù)如圖 1所示, 11種單倍型明顯形成了兩支, 其中Hap4, Hap7, Hap9聚成一支, 其余單倍型聚成一支。2009年和2011年樣品來(lái)源的單倍型分布于各支, 沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的聚群。利用個(gè)體序列構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)樹(shù)與單倍型所建進(jìn)化樹(shù)結(jié)果一致(圖2)。

圖1 榮成灣孔鰩群體線粒體cytb部分序列單倍型鄰接樹(shù)Fig. 1 Haplotype neighbor-joining tree constructed from partial sequences of cytb in Raja porosa stock of the Rongcheng Bay

用Network的Median-joining方法構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)如圖3, 所有單倍型通過(guò)單一突變和多步突變相連接, 單倍型 Hap1是共有的單倍型, 在 2009,2011年群體中所占比例均最高, 據(jù)此推測(cè)Hap1是原始單倍型, 其他單倍型是由其演化而來(lái)[22]。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的結(jié)果也支持不存在與年度相對(duì)應(yīng)的單倍型分支。

2.3 種群歷史動(dòng)態(tài)

榮成灣孔鰩群體的Tajima’s D和Fu’s Fs中性檢測(cè)都呈顯著性負(fù)值(表 2), 此外, 榮成灣群體的歧點(diǎn)分布也呈單峰(圖 4), 表明榮成灣孔鰩群體在過(guò)去可能發(fā)生了種群的快速擴(kuò)張[23-24]。

3 討論

線粒體DNAcytb部分序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性指數(shù)是衡量群體遺傳多樣性水平的重要指標(biāo)。通過(guò)與目前已報(bào)道的其他 8種軟骨魚(yú)類(lèi)的相關(guān)數(shù)據(jù)比較可知(表 3), 榮成灣孔鰩的H與同屬的Raja clavata相近, 略高于西大西洋護(hù)士鯊(Ginglymostoma cirratum)和西南大西洋舒氏星鯊(Mustelus schmitti), 而低于其他5種軟骨魚(yú)類(lèi)。但其π值卻明顯低, 除了與西南大西洋舒氏星鯊接近和略低于三種睡鯊Somniosus pacificus,S. antarcticus和S. microcephalus外, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同科的鰩類(lèi)(Amblyraja radiata)以及鷂鲼科的Aetobatus narinari、甚至同屬的Raja clavata歐洲群體。榮成灣孔鰩具有如此低的H和π值(H＜0.5,P＜0.005), 不僅顯示該群體的遺傳多樣性水平較低, 根據(jù)Grant等[25]的理論推測(cè), 榮成灣孔鰩群體近期也可能發(fā)生了遺傳瓶頸效應(yīng)或奠基者效應(yīng), 其原因是由于孔鰩的遷徙性不強(qiáng), 少與其他群體發(fā)生基因交流所致, 還是其他原因引起的,尚需進(jìn)一步予以考證。

圖2 榮成灣孔鰩群體線粒體cytb部分序列個(gè)體鄰接樹(shù)Fig. 2 Neighbor-joining tree constructed from partial sequences of cytb in R. porosa stock of the Rongcheng Bay

群體遺傳多樣性是生物適應(yīng)環(huán)境與進(jìn)化的基礎(chǔ),物種遺傳多樣性低, 則更容易受到環(huán)境變化和過(guò)度捕撈的影響[26]。從上述分析的多個(gè)群體遺傳多樣性參數(shù)來(lái)看, 榮成灣孔鰩的遺傳多樣性水平相對(duì)較低,僅從遺傳學(xué)角度而言, 該物種的種質(zhì)資源現(xiàn)狀不容樂(lè)觀。作為一種需求量較大的傳統(tǒng)漁業(yè)資源, 其種質(zhì)資源遺傳多樣性的保護(hù)應(yīng)該得到足夠的重視, 并進(jìn)一步采用多種分子標(biāo)記分析對(duì)孔鰩種質(zhì)資源進(jìn)行中長(zhǎng)期評(píng)估, 從而為其種質(zhì)資源保護(hù)政策制定及實(shí)施提供基礎(chǔ), 避免群體遺傳多樣性的急劇下降。

目前關(guān)于水生生物群體遺傳多樣性在時(shí)間動(dòng)態(tài)上的研究相對(duì)空間水平研究較少, 而且主要集中在分析親代和子代之間, 以及不同歷史時(shí)期之間樣本的遺傳差異[27]。本文對(duì)榮成灣2009年和2011年的孔鰩群體的cytb部分序列進(jìn)行分析, 通過(guò)對(duì)反映群體間遺傳分化程度的重要指標(biāo)—遺傳分化系數(shù)計(jì)算發(fā)現(xiàn), 孔鰩在2個(gè)年度群體間的Fst為 0.01778, 表明2個(gè)年度群體間沒(méi)有明顯的分化[28]。AMOVA結(jié)果也顯示, 全部的變異幾乎都來(lái)源于相同年度內(nèi), 年度間變異僅占 2%。采用 Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算孔鰩群體不同年度間的遺傳距離發(fā)現(xiàn), 其值也很小, 僅為0.0015。綜合分析, 說(shuō)明該海域孔鰩群體在時(shí)間上不存在明顯的群體遺傳結(jié)構(gòu)差異, 認(rèn)為這兩個(gè)年度的孔鰩屬同一個(gè)群體。但是, 由于2009年所采集到的樣品數(shù)較少, 今后還需逐年采取足夠的樣品數(shù)進(jìn)行研究, 以更準(zhǔn)確全面地了解榮成灣孔鰩的群體遺傳結(jié)構(gòu)及其年度變化。

圖3 榮成灣孔鰩群體線粒體cytb部分序列單倍型的中接網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 Median Joining Haplotype Network Based on partial sequences of cytb in R. porosa stock of the Rongcheng Bay

圖4 榮成灣孔鰩群體核苷酸不配對(duì)分析圖Fig. 4 Mismatch distribution analysis of cytb partial sequences in R. porosa stock of the Rongcheng Bay

表3 軟骨魚(yú)類(lèi)群體cytb部分序列的H和πTab. 3 The haplotype diverisity (H)and nucleotide diversity (π)parameters of cytb partial sequences in elasmobranches

致謝: 本文所分析的孔鰩底拖網(wǎng)樣品的采集得到中國(guó)科學(xué)院海洋研究所線薇微老師、李文龍老師的幫助, 謹(jǐn)此一并致謝。

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