張 紅, 呂 富, 呂林蘭, 黃金田

(鹽城工學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院, 江蘇 鹽城 224003)

浮游植物的種群生物量是水生生態(tài)系統(tǒng)研究的一個(gè)重要指標(biāo), 葉綠素 a存在于所有浮游植物體內(nèi),占細(xì)胞干質(zhì)量的 1%～2%, 通?？梢杂脕?lái)快速估算種群生物量和浮游植物的增殖能力, 因此浮游植物葉綠素 a含量的測(cè)定成為浮游植物生物量的重要指標(biāo)已被廣泛應(yīng)用[1-4]。葉綠素a常用作水體初級(jí)生產(chǎn)力的衡量指標(biāo), 在水域環(huán)境生物學(xué)研究及漁業(yè)初級(jí)生產(chǎn)力調(diào)查中被廣泛應(yīng)用。

目前, 浮游植物葉綠素 a的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法、熒光光度計(jì)法和分光光度計(jì)法。分光光度計(jì)法因操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)成為了目前普遍使用的測(cè)定浮游植物葉綠素a的方法[5-6]。目前國(guó)際上仍廣泛使用丙酮作為萃取溶劑的單色法測(cè)定浮游植物葉綠素 a的含量, 但從萃取效果和安全性等考慮, 已逐漸采用乙醇作溶劑進(jìn)行萃取。目前已有一些關(guān)于葉綠素 a測(cè)定方法的比較, 熱乙醇法測(cè)定誤差的探討及方法優(yōu)化等的報(bào)道, 但直接以天然養(yǎng)殖池塘的水樣作為分析對(duì)象, 考慮熱乙醇法的各個(gè)因素對(duì)提取葉綠素 a的影響未見(jiàn)報(bào)道[7-9]。因此, 本研究比較了熱乙醇法和丙酮法, 并利用方差分析優(yōu)化熱乙醇法提取浮游植物葉綠素 a方法中各影響因素的最佳條件, 以期得到更為精確、有效、簡(jiǎn)便的測(cè)定方法,為快速估算養(yǎng)殖水體種群生物量提供基本依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水樣取自射陽(yáng)鹽場(chǎng)達(dá)陽(yáng)養(yǎng)殖區(qū) D13池塘, 該塘約13 ha(200畝), 采用鯽魚(yú)為主, 鰱魚(yú)為輔的混養(yǎng)模式, 以五點(diǎn)取樣法, 于水面以下0.5～1.0 m采樣。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水樣的處理和保存

根據(jù)金相燦等[1]的“湖泊富營(yíng)養(yǎng)化調(diào)查規(guī)劃”和章宗涉等[10]的“淡水浮游生物研究方法”所述方法, 取300 mL水樣經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后, 將帶樣品的濾膜剪碎放入10 mL離心管中于冰箱冷凍室–20℃保存。

1.2.2 熱乙醇萃取分光光度法(乙醇法)步驟

1.2.3 丙酮萃取分光光度法(丙酮法)步驟

根據(jù)金相燦等[1]和章宗涉等[10]所述方法, 取帶樣濾膜剪碎后在研缽中加適量 90%丙酮研磨至足夠細(xì), 移入試管中于暗處?kù)o置萃取 4～10 h后, 離心得清液定容, UV-2100型分光光度計(jì)測(cè)定方法同上, 葉綠 素 a 計(jì) 算 公 式 為 : Chla丙酮=27.3×[(E665–E750)–(A665–A750)]×V丙酮/V水樣

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 乙醇法和丙酮法測(cè)定比較

在同一水域采 5個(gè)平行水樣, 同時(shí)用丙酮法和乙醇法測(cè)定葉綠素 a含量, 另在 5個(gè)不同水域采樣,也用兩種方法測(cè)定, 用方差分析F檢驗(yàn)比較結(jié)果。

1.3.2 乙醇-超聲法測(cè)定條件優(yōu)化

在乙醇-超聲法處理時(shí), 試驗(yàn)設(shè)置冷凍時(shí)間為 0和24 h, 各重復(fù)5次。試驗(yàn)設(shè)置萃取時(shí)間依次為2、4、6、8、10 h; 超聲波破碎時(shí)間依次為0、1、2、3、4 min; 水浴溫度依次為 50、60、70、80、90 ℃, 以上各重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇法與丙酮法測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)比較

據(jù)表1結(jié)果, 經(jīng)方差分析F檢驗(yàn),F=20.046大于11.26(F0.01(1.8))。說(shuō)明兩種方法的測(cè)定結(jié)果具極顯著差異, 乙醇法測(cè)定結(jié)果顯著高于丙酮法結(jié)果, 說(shuō)明乙醇法對(duì)浮游植物的葉綠素 a萃取較完全。乙醇法測(cè)定結(jié)果的方差和標(biāo)準(zhǔn)誤差都低于丙酮法測(cè)定結(jié)果,也說(shuō)明乙醇法帶來(lái)的操作誤差較小。

根據(jù)在不同水域樣品的測(cè)定結(jié)果, 計(jì)算相關(guān)系數(shù)R2=0.9990, 說(shuō)明兩方法存在顯著相關(guān)關(guān)系, 回歸方程為: Chla丙酮=1.0932Chla乙醇–11.677(如圖 1)。

2.2 乙醇-超聲法是否凍融測(cè)定結(jié)果的比較

結(jié)果表明, 同一水域的樣品運(yùn)用凍融法測(cè)定結(jié)果極顯著高于非凍融法(表2)。經(jīng)SPSS方差分析, 結(jié)果為S冷凍(0.824)>S不冷凍(0.739), 樣品經(jīng)凍融處理后葉綠素a提取率顯著高于非凍融法。

圖1 測(cè)定葉綠素a含量的乙醇法和丙酮法結(jié)果相關(guān)關(guān)系Fig. 1 The correlation between hot-ethanol and cool-acetone method for measuring chlorophyll a

表1 乙醇法和丙酮法測(cè)定結(jié)果比較Tab. 1 The comparasion between the ethanol and acetone method

表2 凍融對(duì)葉綠素a提取的影響Tab 2 Effect of extraction freezing on extraction of chlorophyll a

2.3 乙醇-超聲法萃取時(shí)間的比較

如圖2所示, 葉綠素a含量隨萃取時(shí)間的增加而增加。萃取時(shí)間為10 h時(shí)葉綠素a含量最高, 但與6 h和8 h萃取時(shí)間相比, 葉綠素a含量沒(méi)有顯著差異; 萃取時(shí)間為4 h和2 h時(shí), 葉綠素a含量均顯著低于6 h。故考慮萃取6 h為宜。

2.4 乙醇-超聲法超聲波破碎時(shí)間的比較

隨超聲波破碎時(shí)間的延長(zhǎng), 葉綠素 a含量逐漸增高(圖 3)。超聲波破碎時(shí)間為 4 min時(shí)達(dá)最高值55.05 μg/L, 與破碎時(shí)間3 min相比, 不存在極顯著差異, 但極顯著高于破碎時(shí)間2 min及以下結(jié)果。因此, 考慮超聲波破碎3 min為宜。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)葉綠素a提取的影響Fig. 2 Effects of extraction time on extraction of chlorophyll a

圖3 超聲波時(shí)間對(duì)葉綠素a提取的影響Fig. 3 Effects of ultrasonic time on extraction of chlorophyll a

2.5 乙醇-超聲法熱提取不同水浴溫度的比較

由圖 4可知, 水浴溫度從 50℃增加到 80℃時(shí),葉綠素 a含量也逐步上升, 在水浴溫度為 80℃時(shí)葉綠素 a含量達(dá)最高值為 73.64 μg/L, 而水浴溫度90℃時(shí)卻突然下降, 且極顯著低于 80℃時(shí)的數(shù)值。故考慮最佳水浴溫度為80℃。

圖4 水浴溫度對(duì)葉綠素a提取的影響Fig. 4 Effects of water bath temperature on extraction of chlorophyll a

3 結(jié)論與討論

3.1 不同萃取方法的葉綠素a的萃取效率

本實(shí)驗(yàn)對(duì)養(yǎng)殖水體的同一水域或不同水域的測(cè)定結(jié)果均顯示, 乙醇-超聲波法的萃取效率顯著高于丙酮法。這與楊彩根等[3]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似, 認(rèn)為乙醇-超聲波法明顯優(yōu)于丙酮法。從試驗(yàn)的易操作性分析,丙酮法樣品磨碎費(fèi)工費(fèi)時(shí), 手工研磨細(xì)胞破碎不完全, 不利于大批量樣品的測(cè)定。同時(shí), 國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的醋酸纖維微孔濾膜在丙酮中完全溶解, 對(duì)分光光度計(jì)吸收值測(cè)定有影響, 也就影響了葉綠素 a質(zhì)量濃度的測(cè)定結(jié)果[11-12]。而乙醇法先利用冷處理破碎細(xì)胞,經(jīng)熱乙醇萃取后再利用超聲波進(jìn)一步粉碎細(xì)胞處理,葉綠素 a的萃取較完全。建議在養(yǎng)殖水體監(jiān)測(cè)及水環(huán)境監(jiān)測(cè)葉綠素a含量領(lǐng)域采用乙醇-超聲波法。

3.2 乙醇-超聲法測(cè)定條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)表明, 運(yùn)用乙醇-超聲法測(cè)定浮游植物葉綠素a含量時(shí), 應(yīng)將帶樣品的濾膜–20℃冰凍24 h以上, 加適量 80℃熱乙醇在 80℃水浴中解凍, 經(jīng)超聲波破碎機(jī)超聲振蕩處理3 min后, 室溫黑暗條件下萃取6 h, 再離心定容測(cè)定。這與趙玉華[13]試驗(yàn)結(jié)果相似, 合適的萃取時(shí)間為6～8 h。梁興飛等[9]由正交優(yōu)化試驗(yàn)得出最佳條件為: 萃取溫度 80℃, 萃取時(shí)間2 h, 乙醇濃度90%, 超聲波(40W, 20kHz)破碎10 min,并且, 隨著超聲波破碎時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 會(huì)造成提取液局部溫度上升, 葉綠素開(kāi)始降解, 進(jìn)而影響葉綠素含量的測(cè)定。

水浴溫度為 80℃, 這與絕大多數(shù)研究結(jié)果相同,當(dāng)水浴溫度達(dá)90℃時(shí), 葉綠素a的值明顯下降, 表明葉綠素因溫度過(guò)高而被破壞[14]。另外乙醇的沸點(diǎn)是81℃, 當(dāng)水浴溫度高于 80℃時(shí)會(huì)使得乙醇部分蒸餾而出, 降低了乙醇的濃度, 影響了熱乙醇的萃取[15]。

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