程莉娟，劉群良，譚 峰，張 波，陳伶利

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

隨著年齡的增加，機(jī)體的氧化和抗氧化系統(tǒng)之間平衡發(fā)生變化，機(jī)體清除氧自由基的能力逐漸減弱，導(dǎo)致氧自由基的增加并積累，造成氧化應(yīng)激。過(guò)剩的自由基作用于細(xì)胞膜、線粒體、核酸、蛋白質(zhì)和酶類，導(dǎo)致不可逆損傷，從而引起衰老、退行性疾病和腫瘤等的發(fā)生[1]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，衰老與腎虛密切相關(guān)，還少丹是中醫(yī)古籍中記載的補(bǔ)腎抗衰名方，該方具有益精補(bǔ)髓，壯元陽(yáng)，卻病延年，發(fā)白返黑的功效。本研究采用D-半乳糖誘導(dǎo)致衰模型小鼠，觀察還少丹對(duì)小鼠腦、肝臟組織SOD、GSH-Px活性以及肝臟、脾臟指數(shù)的影響，以進(jìn)一步闡明該方延緩衰老的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠40只，雌性，7月齡，體質(zhì)量（47.4±4.3）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥物 還少丹源于《濟(jì)陽(yáng)綱目》，主要由中藥何首烏、熟地黃、肉蓯蓉、補(bǔ)骨脂、菟絲子、人參、山藥等組成，購(gòu)自湖南省藥材公司；還少丹水煎劑的制備：取還少丹復(fù)方中藥310 g加水800 mL，煎煮l h，過(guò)濾離心，取濾渣及沉淀加水煎煮l h后再過(guò)濾離心，合并兩次濾液，加熱濃縮至濃度為l g／mL（生藥），置冰箱4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑 D-半乳糖購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；SOD試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器 TGL-16高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自湖南儀器廠；756型分光光度計(jì)購(gòu)自上海光譜儀器有限公司；BP121S電子天平購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司；電熱恒溫水浴箱購(gòu)自北京東霞科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與藥物干預(yù) 將40只雌性小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、衰老模型組、還少丹低劑量組、還少丹高劑量組，每組10只。在無(wú)菌條件下，將D-gal用生理鹽水配制成10 g/L的溶液，以100 mg/kg·d的劑量給衰老模型組、還少丹低劑量組和還少丹高劑量組小鼠頸部皮下注射6周，建立衰老模型；空白對(duì)照組頸部皮下注射等量生理鹽水。同時(shí)，用還少丹水煎劑給還少丹低劑量組和高劑量組小鼠灌胃。小鼠用藥劑量按70 kg成人與20 g小鼠體表面積比值換算。低劑量組用還少丹水煎劑10 g/kg體質(zhì)量灌胃（相當(dāng)于成人劑量的等效劑量），高劑量組用還少丹水煎劑20 g/kg體質(zhì)量灌胃（相當(dāng)于成人劑量的2倍）。空白對(duì)照組和衰老模型組給予等量的蒸餾水灌胃。每周灌胃5 d，連續(xù)給藥6周。

1.2.2 肝、脾指數(shù)的測(cè)定與組織勻漿的制備 給藥6周后，小鼠稱重，斷頭處死，迅速取出小鼠腦、肝臟與脾臟，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗兩次，濾紙拭干稱重，記錄肝、脾的質(zhì)量分別除以體質(zhì)量再乘100%，即得肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。同時(shí)，迅速將小鼠的腦與肝臟剪碎，加入9倍體積生理鹽水于玻璃勻漿器中研碎，離心，所獲上清液即為組織勻漿。用Comas亮藍(lán)蛋白定量法測(cè)定組織蛋白含量。

1.2.3 SOD活性測(cè)定 依照試劑盒說(shuō)明書操作，取2%腦組織勻漿和1%肝組織勻漿各50 μL，分別測(cè)定其SOD活力，結(jié)果以550 nm波長(zhǎng)下的吸光度值計(jì)算酶活性。其活性單位定義為：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所需的SOD量為1個(gè)SOD活力單位（U）。

1.2.4 GSH-Px活性測(cè)定 參考鄧修惠等[2]的方法，取2%腦組織勻漿和0.2%肝組織勻漿各400 μL于測(cè)定管中，同時(shí)加入1 mM GSH 400 μL（用pH7.0，0.2 M磷酸鹽緩沖液配制）；對(duì)照管中加入等體積的1 mM GSH和0.2 M磷酸鹽緩沖液；空白管加入等體積的蒸餾水與磷酸鹽緩沖液。各管置37℃水浴，加入已預(yù)溫的1.25 mM H2O2，混勻，反應(yīng)5 min后，加入三氯乙酸終止反應(yīng)，離心，取上清液加入DTNB顯色液顯色，于422 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管吸光度值計(jì)算酶活性。其活性單位定義為：每小時(shí)每毫克組織蛋白37℃催化1 μmoL GSH氧化的酶量為一個(gè)酶活性單位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 還少丹對(duì)衰老模型小鼠肝臟和脾臟指數(shù)的影響

與模型組比較，空白對(duì)照組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)明顯高于衰老模型組，比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；還少丹低、高劑量組均能提高衰老模型小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。高、低劑量組間肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 還少丹對(duì)衰老模型小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響（±s，n=10）

表1 還少丹對(duì)衰老模型小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較* P＜0.05，**P＜0.01。

組別 藥物劑量（mg/g）肝臟指數(shù) 脾臟指數(shù)模型組空白對(duì)照組還少丹低劑量組還少丹高劑量組20——1 0 3.31±0.43 5.73±0.51**3.87±0.41*3.84±0.47*0.51±0.24 0.96±0.32**0.73±0.16*0.72±0.14*

2.2 還少丹對(duì)衰老模型小鼠腦和肝臟組織SOD活性的影響

與模型組比較，空白對(duì)照組小鼠腦、肝臟組織SOD活性均明顯高于衰老模型組，比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；還少丹低、高劑量組均能明顯升高衰老模型小鼠的腦組織SOD活性，但低、高劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；還少丹低、高劑量組能顯著升高衰老模型小鼠的肝臟組織SOD活性，低、高劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即隨著劑量的增加，對(duì)肝臟SOD活性的影響也增強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 還少丹對(duì)衰老模型小鼠腦、肝臟組織SOD活性的影響（±s，n=10）

表2 還少丹對(duì)衰老模型小鼠腦、肝臟組織SOD活性的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與還少丹低劑量組比較△P＜0.05。

組別 藥物劑量（mg/g）腦SOD（U/mgprot）肝臟T-SOD（U/mgprot）16.00±4.25 26.05±3.90**21.86±2.82**27.60±4.57**△模型組空白對(duì)照組還少丹低劑量組還少丹高劑量組——1 0 20 47.22±3.50 71.20±8.33**47.50±6.42*53.18±5.12*

2.3 還少丹對(duì)衰老模型小鼠腦和肝臟組織GSH-Px活性的影響

與模型組比較，空白對(duì)照組小鼠腦、肝臟組織GSH-Px活性均明顯高于衰老模型組，比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；還少丹低、高劑量組均能明顯升高衰老模型小鼠腦、肝臟組織的GSH-Px活性；低、高劑量組間在腦組織的GSH-Px活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但在肝臟組織中低劑量組的GSH-Px活性明顯高于高劑量組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 還少丹對(duì)小鼠腦、肝臟組織GSH-Px活性的影響（±s，n=10）

表3 還少丹對(duì)小鼠腦、肝臟組織GSH-Px活性的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與還少丹低劑量組比較△P＜0.05。

866.57±47.96 718.42±53.25**861.05±43.79*785.44±61.60*△模型組空白對(duì)照組還少丹低劑量組還少丹高劑量組——1 0 20 80.92±13.03 129.02±8.66**92.93±2.61*92.12±2.68*

3 討論

GSH-Px和SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，可對(duì)抗氧化壓力和自由基損傷。SOD活性可間接反映機(jī)體清除自由基的能力，反映機(jī)體衰老的狀況。脾臟含有豐富的免疫細(xì)胞，主要參與體液免疫，使用免疫增強(qiáng)劑抑制脾臟的萎縮也是延緩衰老的方法之一。另外，肝臟是機(jī)體物質(zhì)代謝重要的“化工廠”[3]，故本試驗(yàn)也選取肝臟指數(shù)作為機(jī)體新陳代謝和免疫能力的檢驗(yàn)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)藥方還少丹由熟地、肉蓯蓉、何首烏等中藥組成。近年來(lái)的研究證實(shí)，還少丹具有提高衰老模型小鼠心肌線粒體功能，降低線粒體DNA缺失的氧化損傷的作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果則進(jìn)一步表明，還少丹還能夠明顯增強(qiáng)衰老模型小鼠腦、肝臟組織抗氧化酶GSH-Px和SOD 活性，通過(guò)清除衰老模型小鼠體內(nèi)的自由基來(lái)實(shí)現(xiàn)延緩衰老的進(jìn)程。同時(shí)，還少丹還能有效提高衰老模型小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)，從而提示該方能有效地增強(qiáng)衰老小鼠免疫功能。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合以往的實(shí)驗(yàn)研究表明，還少丹可通過(guò)多種機(jī)制來(lái)達(dá)到延緩衰老的作用。

[1]Reiter RJ,Paredes SD,Korkmaz A,et al.Melatonin in relation to the“strong”and“weak”versions of the free radical theory of aging[J].Adv Med Sci,2008,53(2):119-129.

[2]鄧修惠,黃學(xué)梅,李偉道,等.改良DTNB比色法測(cè)定血清GSH-Px活力[J].重慶醫(yī)學(xué),2000,29(5):445.

[3]郭紅梅,成月明,潘翠燕,等.恒定磁場(chǎng)對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].生物磁學(xué),2005,5(4):18-19.

[4]程莉娟,劉群良,譚 峰,等.還少丹對(duì)D-半乳糖致衰小鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)與功能的影響[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志,2011,31(2):93-97.

[5]程莉娟,劉群良,譚 峰,等.還少丹對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠心肌線粒體DNA缺失的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(5):20-22.