戴 冰，楊賽男，肖子曾*，何澤云，周芳亮，黃開顏，劉紅宇，邢 瑞

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007)

腎陰虛證本質(zhì)的研究是中醫(yī)基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病屬于“消渴”范疇，其重要病機(jī)特點(diǎn)為陰津虧損、燥熱偏盛，而以陰虛為本，燥熱為標(biāo)。腎陰虛證是2型糖尿病的基本病理變化特點(diǎn)，約占糖尿病患者辨證的85%以上[1]。因此，對2型糖尿病腎陰虛證的研究對于中醫(yī)臨床治療2型糖尿病有著重要意義，而2型糖尿病腎陰虛證動物模型的建立是開展病證研究的首要任務(wù)。

然而國內(nèi)外對于2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的研究卻很少，沒有公認(rèn)的造模方法及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對該模型的穩(wěn)定性的深入研究也甚少。僅見孫永寧[2]、馮雯[3]等采用皮下注射甲狀腺素聯(lián)合腹腔注射STZ，或腹腔注射四氧嘧啶聯(lián)合甲狀腺素灌胃建立糖尿病腎陰虛模型。但他們僅憑大鼠的血糖、外觀體征變化來判斷模型建立是否成功，血糖升高只能判斷動物為糖尿病模型，其是否是腎陰虛證的判斷標(biāo)準(zhǔn)卻很模糊，沒有具體的生化指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)采用高脂乳喂養(yǎng)加小劑量STZ腹腔注射后灌服糖皮質(zhì)激素的方法研究2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的建立，并通過監(jiān)測模型大鼠不同時(shí)期空腹血糖值及血清cAMP水平來探討2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的建立成功與否，以及模型是否穩(wěn)定。旨在探索判斷2型糖尿病腎陰虛證動物模型成模的指標(biāo)以及可行的造模方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康SD（Sprague-Dawley）大鼠,雄性、體質(zhì)量180～220 g，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心（實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(湘)2009-2004）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室溫20～24℃，相對濕度40%～70%。普通飼料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 試劑 枸櫞酸（批號：100823）；磷酸氫二鈉（批號:101125）；鏈脲佐菌素(STZ，批號：S8050，純度98%）購自Sigma 公司；氫化可的松（批號：11021411，天津藥業(yè)焦作有限公司；胰島素（批號: 1102229，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）；環(huán) 磷酸腺苷（cAMP）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號: 20111206）。

1.1.3 儀器 快速血糖儀及血糖試紙：美國羅氏公司；冰箱：海爾集團(tuán)；半自動生化分析儀：ca-958d型；旋渦混勻器：WH-1型，上海滬西分析儀器廠；電子天平：AG204型梅特勒-托利多；水浴鍋：北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；臺式自動平衡離心機(jī)：TD4-Ⅱ型，長沙平凡儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高脂乳的制備 按比例配置新鮮高脂乳（30%丙二醇、20%吐溫-80、20%豬油、6%食鹽、5%膽固醇、5%果糖、5%蔗糖、1%谷氨酸鈉、1%丙硫氧嘧啶、蒸餾水適量）。稱取膽固醇5 g，蔗糖5 g，果糖5 g，丙硫氧嘧啶1 g，谷氨酸鈉1 g，食鹽6 g，量取20 mL吐溫-80，豬油20 mL，丙二醇30 mL，蒸餾水適量。將豬油置于水浴鍋中融化成液體狀，并將丙二醇加熱，待用。先將膽固醇、蔗糖、果糖研磨成細(xì)粉狀混合，加適量蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚝?，加入已研碎的丙硫氧嘧啶，攪拌混勻，然后加入已加熱成液體狀的豬油混勻。將以上混合物與吐溫-80加入到已加熱的丙二醇中，邊加邊攪拌，待稍冷卻后加入谷氨酸鈉和食鹽，加入適量蒸餾水至100 mL，4℃保存。

1.2.2 動物分組 SD大鼠隨機(jī)分為2組：A組（普通飼料喂養(yǎng)組即對照組）6只，B組（高脂乳結(jié)合STZ及氫化可的松組即2型糖尿病腎陰虛證模型組）15只。

1.2.3 2型糖尿病大鼠模型的制備 參照文獻(xiàn)[4]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，模型組給予高脂乳喂養(yǎng)10 mL/（kg·d），空白對照組給予等量蒸餾水。持續(xù)10 d后，所有動物禁食不禁水12 h后，模型組大鼠腹腔注射STZ 40 mg/（kg·d），空白對照組腹腔注射等體積枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液。15 min后，給大鼠腹腔注射胰島素4 U，2.5 h時(shí)和5 h時(shí)灌胃給予25%葡萄糖10 mL/kg，64 h時(shí)開始禁食不禁水，72 h時(shí)檢測大鼠空腹血糖值?？崭寡侵怠?6.7 mmoL/L為方可繼續(xù)造模。

1.2.4 2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的建立 在2型糖尿病模型的基礎(chǔ)上，采用灌胃糖皮質(zhì)激素的方法制作腎陰虛模型[5]。2型糖尿病模型大鼠禁食12 h，按照35 mg/kg劑量灌服5 mg/mL/d氫化可的松，連續(xù)灌胃4 d，檢測大鼠空腹血糖值及血清cAMP，并以大鼠空腹血糖，值≥16.7 mmoL/L且血清cAMP上升者為2型糖尿病腎陰虛大鼠模型；繼續(xù)高脂乳喂養(yǎng)30 d后，再次檢測大鼠空腹血糖值及血清cAMP，對模型穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià) 。

1.2.5 標(biāo)本采集 大鼠禁食10 h，腹腔注射10%水合氯醛生理鹽水溶液0.35 g/kg麻醉，腹主動脈取全血，靜置，分離血清，-20℃凍存待檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 2型糖尿病腎陰虛證大鼠體征變化

模型大鼠體質(zhì)量下降，精神不振，活動減少，反應(yīng)較遲鈍，體毛無光澤、粗糙發(fā)黃暗淡，大便稍干結(jié)，色黑，肛門出現(xiàn)紅腫，飲水增加，進(jìn)食量增加，尿量增加，尿黃，痛閾值降低等，與中醫(yī)腎陰虛證相吻合。

2.2 2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型血糖值變化

模型組與空白對照組比較，STZ注射72 h后模型組大鼠空腹血糖明顯高于空白對照組，比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,大鼠空腹血糖值≥16.7 mmoL/L，2型糖尿病大鼠模型造模成功；造模成功30 天后模型組大鼠空腹血糖仍明顯高于空白組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示該模型穩(wěn)定性較好。結(jié)果見表1。

表1 兩組大鼠不同時(shí)期空腹血糖值比較（±s，mmoL/L）

表1 兩組大鼠不同時(shí)期空腹血糖值比較（±s，mmoL/L）

注：與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n STZ注射72 h后血糖 灌胃氫化可的松后血糖 造模30 d后血糖空白組 6 6.00±0.50 6.00±0.48 6.08±0.35模型組 15 19.50±2.00** 19.40±2.05** 18.40±2.05**

2.3 2型糖尿病腎陰虛證大鼠血清cAMP的變化

與空白對照組比較，模型組大鼠成模時(shí)及成模30 d后血清cAMP水平明顯高于空白對照組，比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示該2型糖尿病模型是腎陰虛型，且腎陰虛持續(xù)、穩(wěn)定。結(jié)果見表2。

表2 兩組大鼠不同時(shí)期血清cAMP值比較（mmoL/L）

3 討論

環(huán)核苷酸是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能活動的重要物質(zhì)，cAMP是由ATP 經(jīng)腺苷酸環(huán)化酶及Mg+的作用生成的，能對細(xì)胞內(nèi)很多代謝過程產(chǎn)生影響[6]。許多研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)陽虛患者的血漿cAMP/cGMP比值降低；而陰虛患者則表現(xiàn)為cAMP含量及cAMP/cGMP比值升高[7]。有研究表明，糖尿病患者的血漿cAMP及cAMP/cGMP比值均發(fā)生明顯變化[8]。由此可見，血清cAMP含量變化是2型糖尿病腎陰虛證辨證的重要指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2型糖尿病腎陰虛大鼠在表現(xiàn)出典型的糖尿病癥狀多飲、多食、多尿、體質(zhì)量下降，血糖值≥16.7 mmoL/L的同時(shí)，血清cAMP水平也明顯升高，在2型糖尿病腎陰虛證模型建立30 d后，其血糖值仍≥16.7 mmoL/L，血清cAMP仍明顯高于正常對照組，提示大鼠血清cAMP與糖尿病腎陰虛證密切相關(guān),表明大鼠血清cAMP的變化可以作為2型糖尿病腎陰虛證模型成功與否及其穩(wěn)定性的判斷指標(biāo)之一。

本實(shí)驗(yàn)綜合借鑒2型糖尿病大鼠[9-10]及腎陰虛大鼠[11]兩種模型的造模方法，成功地建立了2型糖尿病腎陰虛大鼠模型，并且以血糖值≥16.7 mmoL/L且血清cAMP上升作為判斷模型成功與否的標(biāo)準(zhǔn)，對于2型糖尿病腎陰虛證動物模型的建立及評價(jià)有重要的意義。而血清cAMP值究竟要上升多少才可以判斷為糖尿病腎陰虛證，以及2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的建立還可以采用哪些指標(biāo)作為評價(jià)指標(biāo)都需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究來確立。

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