胡 琪，饒力群，唐忠海，馮靜弦

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

顏色是衡量食品質(zhì)量的重要指標之一，19世紀以前人們都使用天然色素著色。1856年英國的Perkins發(fā)明了第一個合成有機色素——苯胺紫，揭開了合成色素應用的新紀元[1]。由于合成色素具有色澤鮮艷、著色力強、穩(wěn)定性好及成本低廉等優(yōu)點，所以幾乎取代了天然色素在食品中的應用[2]。近年來，人工合成色素的毒性和不良影響不斷被發(fā)現(xiàn)，天然食用色素的開發(fā)和應用就越來越被人們所重視。梔子黃色素是從梔子果實中提取出來的一類天然水溶性黃色素，作為天然食用色素，它安全無毒，應用范圍廣，成本較低，著色力強，具有一定的營養(yǎng)價值，在世界市場上頗受歡迎[3-4]。

響應面分析法（Response Surface Methodology,RSM）是一種優(yōu)化工藝的有效方法，可用于確定各自變量因素及其交互作用在工藝過程中對響應值的影響，精確表達因素和響應值之間的關系[5-6]，尋求最佳工藝參數(shù)。近年來，響應面分析法已被越來越多的應用于食品工業(yè)的分析研究中，但是在梔子黃色素提取工藝的研究尚未見報道。本文以提取液在波長為440 nm處的吸光值（A）為響應值，在單因素實驗的基礎上，利用響應面法對梔子黃色素的浸提工藝進行了優(yōu)化，得到提取工藝的最優(yōu)組合，以提高梔子黃色素的提取效率，達到提高色價的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料 梔子果實，購于長沙市高橋批發(fā)市場，剝殼，粉碎，備用。

1.1.2 試驗試劑 無水乙醇，分析純，長沙安泰精細化工實業(yè)有限公司；超純水，湖南農(nóng)業(yè)大學純水室提供。

1.1.3 試驗儀器與設備 RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），電熱恒溫風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司），回流提取儀、ALZ04電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），F(xiàn)W177中草藥粉碎機（天津泰斯特），紫外-可見分光光度檢測器（Agilent1100）。

1.2 試驗方法

1.2.1 梔子黃色素的提取 精確稱取10 g梔子黃粉末于圓底燒瓶中，加入一定量一定濃度的乙醇，在一定溫度下浸提一定時間，提取液抽濾，濃縮回收乙醇，得粗提液。

1.2.2 測定方法 采用分光光度法測定440 nm處提取液的吸光值A440。用1 cm的比色皿，以蒸餾水為空白，粗提液于Agilent1100紫外－可見分光光度計上進行測定。

1.2.3 響應面法優(yōu)化提取條件 在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behaken方法[7-8]，選取主要影響因素作為自變量，吸光值A做為響應值。通過響應曲面進行梔子黃色素提取工藝的研究。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對吸光值的影響 按1.2.1方法，在60%乙醇、料液比1∶12、溫度60℃、提取1次的條件下，考察不同提取時間對吸光值的影響，結果見圖1。由圖1可知，提取時間從2 h到4 h時，吸光值在不斷的增大，4 h時達到最大值，繼續(xù)延長提取時間，吸光值變小，可能是由于提取時間過長原料中的雜質(zhì)被不斷溶出，影響了提取效果。

圖1 提取時間對吸光值的影響

2.1.2 乙醇濃度對吸光值的影響 按1.2.1方法，在提取時間為4 h、料液比1∶12、溫度60℃、提取1次的條件下，考察不同乙醇濃度對提取效果的影響，結果見圖2。由圖2可知，乙醇濃度從40%到60%時，吸光值在不斷的增大，60%時達到最大值，繼續(xù)加大乙醇濃度，吸光值變小?？赡苁怯捎谝掖紳舛冗^高，導致部分梔子黃色素被破壞。

圖2 乙醇濃度對吸光值的影響

2.1.3 料液比對吸光值的影響 按1.2.1方法，在60%乙醇、提取時間為4 h、溫度60℃、提取1次的條件下，考察不同料液比對提取效果的影響，結果見圖 3。由圖3 可知，料液比從 1∶6 到 1∶12 時，吸光值在不斷的增大，1∶12時達到最大值，繼續(xù)加大料液比值，吸光值變小，可能是由于原料中其他成分過多溶出反而不利于色素的提取，影響了提取效果。

圖3 料液比對吸光值的影響

2.1.4 提取溫度對吸光值的影響 按1.2.1方法，在60%乙醇、料液比1∶12、提取時間為4 h、提取1次的條件下，考察不同提取溫度對提取效果的影響，結果見圖4。由圖4可知，提取溫度從40℃到60℃時，吸光值不斷增大，60℃時達到最大值，繼續(xù)升高溫度，吸光值變小，可能是由于溫度過高，原料中的梔子黃色素被破壞，影響了提取效果。由圖4看出，提取曲線比較平緩，說明提取溫度不是提取效率的主要影響因素。

圖4 溫度對吸光值的影響

2.2 響應面法優(yōu)化梔子黃色素的提取工藝

2.2.1 響應面分析方案與試驗水平 根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，在單因素實驗結果基礎上，選取乙醇濃度、料液比、提取時間3個因素的合適水平，對提取工藝進行3因素3水平響應面分析試驗，其具體試驗方案見表1。

表1 響應面分析因素水平表

2.2.2 響應面分析結果 對梔子黃色素提取工藝進行響應面分析，結果見表2。

2.2.3 方差分析和二次回歸方程擬合 利用Design Expert軟件對試驗結果進行二次多元回歸擬合，得到以梔子黃色素吸光值為響應值，與編碼自變量X1，X2，X3的二次多項回歸方程：

模型的可靠性可從方差分析（表3）及相關系數(shù)來考察。結果表明，模型是顯著的（p<0.05），此模型線性相關系數(shù)R2=0.922 2，調(diào)整性決定系數(shù)R2=0.822 1，說明回歸方程擬合度很好，能夠很好地描述試驗結果，可以用此模型對梔子黃色素提取量進行分析和預測[9]。由F檢驗可以得到因子貢獻率為X2>X3>X1，即料液比>時間>乙醇濃度。

此回歸模型預測了乙醇濃度（X1）、料液比（X2）和提取時間（X3）在梔子黃色素提取中的作用。從變量和響應值之間關系的方差分析（表3）中可知：X2、X32極顯著，X2X3、X12顯著。由此可知，X2、X2X3、X12、X32對吸光值A有比較顯著的影響，而其他因素的影響相對較小。各個具體實驗因子與響應值都不是簡單的線性關系。

表2 響應面分析方案及實驗結果

2.2.4 交互作用分析 各因素X1、X2、X3對響應值A440所構成的三位空間的曲面圖，可反映各因素對響應值的影響。響應面圖可較為直觀的看出各因素對吸光值的影響，曲線越陡峭，表明該因素對吸光值的影響越大，由等高線圖可以看出存在極值的條件應該在圓心處。圖5～圖7表明，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對梔子黃溶液吸光值的影響，料液比最大（X2），提取時間次之（X3），乙醇濃度（X2）的影響最小。這也符合表3中對方程3個交互項的方差結果分析。比較3組等高線可知，圖6的高等線圖呈橢圓形，說明X2、X3的交互作用較顯著。

2.2.5 驗證試驗 在軟件給出的處理方案中本實驗選擇的最佳工藝條件為乙醇濃度58.36%（實際取 58%），料液比 1∶10，提取時間 4.18 h（4.2 h）時，預測最優(yōu)值為0.748 2。根據(jù)選擇的最佳工藝進行試驗來驗證是否符合模型方程式預測的最佳響應值，進行3次平行試驗，得到梔子黃色素提取液實際吸光值為0.735 2，與理論值相差不顯著，說明響應值的實驗置與回歸方程預測值吻合良好，證明優(yōu)化結果可信，具有實用價值。

表3 響應面分析方案與實驗結果

圖5 乙醇濃度和料液比對吸光值的響應面圖和等高線圖

圖6 乙醇濃度和提取時間對吸光值的響應面圖和等高線

圖7 料液比和提取時間對吸光值的響應面圖和等高線圖

3 結論

用響應面分析法建立了梔子黃色素提取過程中，乙醇濃度、料液比、提取時間3個影響因素的回歸模型，并對模型經(jīng)過分析檢驗，試驗結果表明響應面法優(yōu)化梔子黃色素提取工藝可行。

通過Design-Expert7.0軟件采用Box-Benhnken實驗設計對梔子黃色素提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到了最佳提取工藝為：乙醇濃度58.36%，料液比1∶10，提取時間4.18 h，梔子黃色素提取液在波長440 nm處最大預測吸光值為0.748 2。結合生產(chǎn)實際，可調(diào)整梔子黃色素提取的最佳工藝條件為乙醇濃度58%、料液比1∶10、提取時間4.2 h，實際吸光值為0.735 2。本研究可為工業(yè)化最大效率利用梔子資源，提取天然梔子黃色素提供生產(chǎn)數(shù)據(jù)。

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