楊 帆，羅 琳，魏建宏，何 飚

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，湖南 長沙 410128）

從20世紀80年代開始我國農(nóng)業(yè)得到大力發(fā)展，各種糧食作物的產(chǎn)量大幅度提高，但是在解決了糧食問題的同時，各種作物秸稈的量隨著糧食產(chǎn)量的提高不斷增加，大量秸稈的堆積給環(huán)境造成了壓力，秸稈的處理方式形成了新的環(huán)境問題[1]。秸稈催腐劑是一種高效的微生物制劑，它能將秸稈催腐后進行還田利用[2]。腐稈劑內(nèi)含有大量的各種微生物群體，且能分泌多種微生物酶催化分解秸稈中的粗纖維，從而使秸稈迅速腐爛[3]，同時它的使用對土壤的抗病、增肥也具有一定的作用[4]。因此，研究腐稈劑在催腐秸稈過程中所產(chǎn)生的生化作用及其機理具有重要意義[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

采用由佛山金葵子科技有限公司提供的秸稈腐熟劑作為研究對象，水稻秸稈采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)周邊稻田。試驗中所用儀器、器皿均經(jīng)過高溫高壓消毒。

1.2 試驗設(shè)計

分別稱取30 g稻草粉加入6個（1個處理樣，1個對照樣，3個重復(fù)）500 mL錐形瓶中，同時稱取10 g稻草粉加入6個250 mL錐形瓶中。在500 mL錐形瓶處理樣中加入0.06 g的腐稈劑混勻。在250 mL錐形瓶處理樣中加入0.02 g的腐稈劑混勻。所有錐形瓶均置于30℃培養(yǎng)。

1.3 測定指標和分析方法

每3 d無菌條件下稱取5.000 0 g+0.000 1 g樣品，1 g放入100 mL錐形瓶中，并相應(yīng)貼好標簽，用移液管各加蒸餾水10 mL，稍作振蕩后，放入200 r/min搖床中振蕩浸提1 h。振蕩完畢后，略靜置，用濾紙過濾再將清液裝入離心管，蓋好蓋子，對稱放入離心機，在10 000 r/min下離心15 min。上清液用于檢測纖維素酶、半纖維素酶、酚氧化酶的活性。2 g用于微生物群落測定，2 g烘干測定含水率，烘干樣用于木質(zhì)纖維素三組分含量的測定。

1.3.1 纖維素酶酶活力的測定 主要檢測內(nèi)切葡聚糖酶活力。取0.1 mL適當(dāng)稀釋酶液，加入0.9 mL 0.05 mol/L pH 4.8的檸檬酸緩沖溶液配制成的1%羧甲基纖維素鈉溶液，50℃下反應(yīng)30 min，用DNS法測定還原糖。定義釋放1 μmol/min還原糖所需的酶量為1個酶活單位U。纖維素酶的酶活力單位用下式計算：

式中：A為OD值在標準曲線上對應(yīng)的木糖量（mg）；D為酶液稀釋倍數(shù)。

1.3.3 酚氧化酶酶活力的測定 1 cm光徑比色杯中含總反應(yīng)體系2.9 mL（2.85 mL 0.2 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液，50 μL 60 mmol/L的兒茶酚溶液），加入100 μL酶液啟動反應(yīng)。在25℃、420 nm下測定反應(yīng)3 min后光密度的增加值。定義3 min內(nèi)引起光密度增加0.01的酚量為1個酶活單位U。

1.3.4 微生物群落的演替 采用純種分離技術(shù)，平板菌落計數(shù)方法分別計算細菌、真菌和放線菌的數(shù)量。

1.3.5 木質(zhì)纖維素三組分的測定 參照王玉萬等[6]的定量分析程序測定木質(zhì)纖維素3種組分含量，并計算出各組分的絕對含量及其降解率。

式中：A為OD值在標準曲線上對應(yīng)的葡萄糖量（mg）；D為酶液稀釋倍數(shù)。1.3.2 半纖維素酶酶活力的測定 主要檢測木聚糖酶活力。取0.1 mL適當(dāng)稀釋酶液，加入0.9 mL 0.1 mol/L pH 4.8的醋酸緩沖溶液配制成的1%木聚糖溶液，50℃下反應(yīng)60 min，用DNS法測定還原糖。定義釋放1 μmol/min還原糖所需的酶量為1個酶活單位U。半纖維素酶的酶活力單位用下式計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 添加腐稈劑對稻草腐解過程中纖維素酶的影響

添加腐稈劑對稻草腐解過程中纖維素酶的活性的影響如圖1所示，與對照相比，添加腐稈劑后纖維素酶的活性在前3 d基本沒什么變化，而在隨后的培養(yǎng)過程中，纖維素酶的活性均比空白要高，說明添加腐稈劑有利于纖維素酶活的產(chǎn)生，且?guī)缀踉谡麄€發(fā)酵過程中均有所增強。

2.2 添加腐稈劑對稻草腐解過程中半纖維素酶的影響

圖1 羧甲基纖維素酶的活性變化

添加腐稈劑對稻草腐解過程中半纖維素酶的活性的影響如圖2所示，添加腐稈劑后半纖維素酶的活性從一開始就表現(xiàn)出增加趨勢，在6～12 d幾乎保持穩(wěn)定的活性，在培養(yǎng)后期有所下降，但總體比空白樣中的酶活要高。

圖2 木聚糖酶的活性變化

2.3 添加腐稈劑對稻草腐解過程中酚氧化酶的影響

添加腐稈劑對稻草腐解過程中酚氧化酶的活性的影響如圖3所示，添加腐稈劑后酚氧化酶的活性在培養(yǎng)初期并沒有增加，但從第9天開始便呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。

圖3 酚氧化酶的活性變化

2.4 添加腐稈劑對稻草腐解過程中生物量的影響

2.4.1 細菌微生物量的變化 細菌微生物量的變化曲線如圖4所示，經(jīng)過3 d的腐解后，添加了腐稈劑的處理樣中細菌數(shù)量明顯增加，但在后期數(shù)量沒有明顯優(yōu)勢，這是因為腐稈劑中含有大量纖維素分解細菌，而纖維素和半纖維素的分解主要發(fā)生在腐解的前期過程。同時研究中發(fā)現(xiàn)在添加了腐稈劑的處理樣中主要有幾種優(yōu)勢菌，這可能是因為腐稈劑中含有的大量纖維素分解細菌在腐解過程逐漸成為優(yōu)勢菌種。

圖4 稻草腐解過程中細菌微生物量的變化

2.4.2 真菌微生物量的變化 真菌微生物量的變化曲線如圖5所示，在腐解的前6 d，添加了腐稈劑的處理樣中真菌的數(shù)量與空白樣中相當(dāng)甚至更低一些，但從第9天開始，其中的真菌數(shù)量明顯多于空白樣，這可能是因為腐稈劑中含有大量木質(zhì)素分解真菌，而木質(zhì)素的降解又主要發(fā)生在纖維素和半纖維素的降解之后，即發(fā)酵過程的后期階段。因此，真菌數(shù)量在后期才表現(xiàn)出明顯的增長趨勢。

圖5 稻草腐解過程中真菌微生物量的變化

2.4.3 放線菌微生物量的變化 放線菌微生物量的變化曲線如圖6所示，在整個腐解過程中，添加了腐稈劑的處理樣中的放線菌微生物量均高于空白樣，這可能是因為腐稈劑中含有大量具有分解纖維素和木質(zhì)素的放線菌，并且在腐解的整個過程中都表現(xiàn)出較強的生長優(yōu)勢。

2.5 添加腐稈劑對稻草腐解過程中木質(zhì)纖維素三組分降解率的影響

2.5.1 纖維素降解率的變化 纖維素降解率的變化曲線如圖7所示，經(jīng)過18 d的腐解，空白樣與添加了腐稈劑的處理樣纖維素降解率分別為28.91%，37.88%，這說明添加腐稈劑對纖維素的降解起到了一定的促進作用。同時從圖中還可以看到，各個樣品的纖維素降解主要發(fā)生在3 d以后，這與監(jiān)測的纖維素酶活數(shù)據(jù)反映的情況基本一致。

圖6 稻草腐解過程中放線菌微生物量的變化

圖7 稻草腐解過程中纖維素降解率的變化

2.5.2 半纖維素降解率的變化 半纖維素降解率的變化曲線如圖8所示，隨著腐解過程的進行，各個堆體的半纖維素的降解率都呈明顯的上升趨勢。經(jīng)過18 d的腐解，空白樣與添加了腐稈劑的處理樣纖維素降解率分別為28.68%，36.87%，這說明添加腐稈劑對半纖維素的降解起到了一定的促進作用。同時從圖中還可以看到，各個樣品的半纖維素降解從一開始就有發(fā)生，而與之對應(yīng)的半纖維素酶活也是從一開始就表現(xiàn)出增強的趨勢。

圖8 稻草腐解過程中半纖維素降解率的變化

2.5.3 木質(zhì)素降解率的變化 木質(zhì)素降解率的變化曲線如圖9所示，經(jīng)過18 d的腐解，空白樣與添加了腐稈劑的處理樣木質(zhì)素降解率分別為12.29%和17.82%，同時從圖中還可以看到，各個樣品的木質(zhì)素在前期降解不明顯，在后期才表現(xiàn)出較強的降解能力。

圖9 稻草腐解過程中半纖維素降解率的變化

3 結(jié)論

（1）腐稈劑的添加在稻草腐解過程中對纖維素酶、半纖維素酶、酚氧化酶的活性均有明顯影響，腐稈劑對促進秸稈腐化進程有顯著效果。

（2）添加腐稈劑后細菌、真菌和放線菌的生物量均有明顯增加，但具有促進作用的時間有所不同。細菌的生物量主要在腐解前期增加，而真菌的生物量主要在腐解后期增加，放線菌的生物量在整個腐解過程都表現(xiàn)出較強的增加趨勢。

（3）添加腐稈劑后，稻草秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率均有所提高。這說明：腐稈劑中富含有大量的纖維素降解菌和木質(zhì)素降解菌，它們在生長繁殖過程中分泌出大量纖維素酶、半纖維素酶和酚氧化酶，從而促進木質(zhì)纖維素三組分的降解。

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