汪龔澤，劉朝奇，楊建林，覃曉琳，呂佰瑞，姚佳紅

（三峽大學(xué)分子生物學(xué)研究所，湖北宜昌443002）

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是艾滋病的病原體，主要通過性接觸、血液和母嬰傳播。近年來，HIV感染呈上升趨勢。中國自1985年發(fā)現(xiàn)第一例艾滋病患者以來，截至2009年10月底，累計報告艾滋病病毒感染者和患者319 877例，2009年當(dāng)年新發(fā)HIV感染者4.8萬人，中國艾滋病疫情形勢嚴(yán)峻［1］。而目前檢測血清HIV抗體是診斷HIV感染的常規(guī)方法，但該檢測具有較大的局限性，這是因?yàn)椋撼^70%的HIV感染者在感染6個月后才能檢測出抗體，在同性戀群體中，這個數(shù)字超過80%，檢測抗體方法增加了HIV“窗口期”傳播的危險［2］；另外，新生兒產(chǎn)生 HIV抗體一般在出生1年后，來自母體的HIV抗體造成新生兒假陽性；由于HIV抗體在疾病過程中持續(xù)存在，到艾滋病晚期才消失，它無法作為治療監(jiān)測的穩(wěn)定指標(biāo)［3］。

P24是HIV病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是結(jié)構(gòu)基因gag的產(chǎn)物，在病毒的包裝和成熟過程中發(fā)揮重要作用［4］。P24蛋白的氨基酸序列在HIV各毒株之間高度保守，缺失P24的病毒無法正常組裝。P24蛋白特異性很強(qiáng)，與多數(shù)其他逆轉(zhuǎn)錄病毒無交叉反應(yīng)。HIV感染人體后，感染者血液中首先出現(xiàn)的病毒標(biāo)志物為病毒P24蛋白。由于從病毒感染到檢出抗HIV抗體之間存在較長的窗口期，因此，HIV－1P24抗原檢測在HIV感染的早期診斷、預(yù)后判斷、抗HIV藥物篩選及判斷母嬰傳播等方面具有重要意義［5－6］。目前，人們在提高 HIV－1 P24抗原敏感性方面進(jìn)行了不斷的探索，dos Ramos Farías等［7］將嬰兒的血清樣本離心，可顯著增加P24抗原檢測的敏感性。瑞士逆轉(zhuǎn)錄病毒國家研究中心報道了一種緩沖液，在檢測過程中使用該緩沖液可提高P24抗原的檢測能力［8］。本課題組克隆表達(dá)P24蛋白，獲得P24單克隆抗體細(xì)胞株，進(jìn)行臨床樣本檢測，為檢測HIV感染提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 實(shí)驗(yàn)所需限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及TaqDNA聚合酶均購自Fermentas公司。菌株E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、質(zhì)粒pET28a（＋）和 HIV－1hbx2重組質(zhì)粒由本研究所保存。鼠抗聚組氨酸（histidine，His）標(biāo)簽抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Balb／c小鼠購自湖北省實(shí)驗(yàn)動物中心。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）（MW1500）購自Fluka公司。小鼠骨髓瘤SP2／0細(xì)胞為本研究所保存。

1.2 pET28a（＋）－p24基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以 HIV－1hbx2基因?yàn)槟０?，聚合酶鏈反?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法擴(kuò)增p24基因。設(shè)計引物為：5′－CAG GAT CCC TAT AGT GCA GAA CAT CCA GG－3′；5′－CGA CTC GAG CAA AAC TCT TGC CTT ATG G－3′，其引物中分別引入酶切位點(diǎn)BamHI／XhoI。原核表達(dá)載體pET28a（＋）用BamHI／XhoI雙酶切將其線性化后，與p24目的基因的酶切產(chǎn)物于16℃連接過夜。5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli DH5α中，接種LB卡那霉素抗性固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆至1.5mL卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日提取質(zhì)粒用于酶切和測序鑒定。

1.3 pET28a（＋）－p24基因原核表達(dá)與鑒定 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a（＋）－p24轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21（DE3）中，經(jīng)異丙基－D－硫 代 半 乳 糖 苷 （isopropyl－beta－D－thiogalactopyranoside，IPTG）（終濃度1.0mmol／L）誘導(dǎo)表達(dá)，收集的細(xì)菌加入等體積2×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）凝膠上樣緩沖液，100℃煮沸3min，冰浴4min，室溫下離心1min（離心半徑8cm，12 000r／min），取20μL進(jìn)行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）［9］?？捡R斯亮藍(lán)染色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測表達(dá)產(chǎn)量。Western blot檢測重組pET28a（＋）－P24蛋白，SDS－PAGE后轉(zhuǎn)移硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉封閉；加抗His標(biāo)簽單克隆抗體（1∶500）室溫輕搖作用2h；TBST（Tris－buffered saline with Tween－20）洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2 000）室溫反應(yīng)2h，洗滌同上；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminecence，ECL）顯色。

1.4 pET28a（＋）－P24蛋白的純化 質(zhì)粒 pET28a（＋）－P24陽性菌BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，將細(xì)菌重懸 于 BufferA（0.5mol／L NaCl，20mmol／L Tris－HCl，pH 8.0）中，4℃超聲波破碎細(xì)菌，離心洗滌包涵體，8mol／L尿素變性增溶，經(jīng)Ni－NTA瓊脂糖親和柱分離純化目的蛋白。純化蛋白經(jīng)透析法復(fù)性，尿素濃度梯度依次為6.00、4.00、2.00、1.00、0.25、0.10及0.00mol／L，每個濃度透析時間為12h。

1.5 制備P24單克隆抗體 以50μg P24蛋白抗原與弗氏完全佐劑混合制成乳劑，經(jīng)皮內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫。1個月后，用相同劑量的抗原加弗氏不完全佐劑經(jīng)小鼠尾靜脈進(jìn)行加強(qiáng)免疫3次，每次間隔2周。經(jīng)免疫后小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2／0細(xì)胞以50%PEG促融。培養(yǎng)至第10天，采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）法篩選陽性孔，有限稀釋法克隆化3次至克隆生長孔100%陽性，克隆化后的細(xì)胞株經(jīng)傳代確定為穩(wěn)定的細(xì)胞株后，液氮保存。每只Balb／c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5mL，10d后每只小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1×106個，制備腹水模型。取腹水單克隆抗體經(jīng)飽和硫酸銨分級沉淀，用雙蒸水溶解，收集，加等量無菌丙三醇，于－20℃保存。

1.6 P24單克隆抗體的鑒定及抗體效價的檢測 Western blot鑒定P24單克隆抗體：取P24蛋白及陰性和陽性對照蛋白進(jìn)行SDS－PAGE，制備抗原條帶。用5%脫脂奶粉封閉，分別以His標(biāo)簽抗體、P24單克隆抗體或正常小鼠血清作為第一抗體（1∶500）室溫輕搖作用2h；TBST洗滌3次，每次5min；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2 000）室溫反應(yīng)2h，洗滌同上；ECL顯色。ELISA法檢測抗體效價：用碳酸鹽緩沖液包被P24抗原（濃度為1μg／mL、每孔100μL）4℃包被16h，使用PBST（phosphate buffered solution with Tween－20）洗 滌ELISA板3次，37℃封閉1h。每塊ELISA板分別以稀釋倍數(shù)為1∶100、1∶500、1∶2 500、1∶12 500、1∶62 500、1∶312 500、1∶1 562 500的抗體作為第一抗體加入ELISA板，其中以PBST代替P24單克隆抗體作為陰性對照。37℃孵育1h后，用PBST洗滌ELISA板3次，并在洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2 000）作為第二抗體，37℃孵育1 h后，洗滌同上，四甲基聯(lián)苯胺顯色，2mol／L H2SO4終止反應(yīng)，在450nm波長處檢測吸光度值。

1.7 血清P24含量的檢測 采用競爭抑制ELISA方法，用碳酸鹽緩沖液包被P24抗原（濃度為1μg／mL、每孔100μL），37℃封閉1h。每孔加入P24單克隆抗體（1∶200）和不同濃度的P24蛋白于37℃孵育1h，其中陰性對照不加P24單克隆抗體，陽性對照不加P24蛋白。洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2000），37℃孵育1h，洗滌同上，四甲基聯(lián)苯胺顯色，檢測吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以P24蛋白為抗原包被，包被濃度同上，0.5%Triton X－100處理 HIV－1陽性的血清樣本，1∶50稀釋后，與1∶200稀釋的P24單克隆抗等體積混合，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2 000），37℃孵育1h，洗滌，四甲基聯(lián)苯胺顯色，檢測吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pET28a（＋）－p24片段的構(gòu)建 應(yīng)用PCR方法從HIV－1基因中獲得p24基因片段，經(jīng)內(nèi)切酶、連接酶將其插入pET28a（＋）載體中，獲得pET28a（＋）－p24重組質(zhì)粒。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a（＋）－p24經(jīng)BamHI／XhoI雙酶切鑒定，得到693bp的目的條帶，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期大小相同，見圖1。DNA測序鑒定結(jié)果與本課題組設(shè)計的HIV－1 p24（hbx2）獲取片段的核苷酸序列一致。

2.2 SDS－PAGE和 Western blot分析 將重組pET28a（＋）－P24質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。1.0mmol／L IPTG 誘導(dǎo)4～6h后，表達(dá)蛋白經(jīng)12%SDSPAGE。誘導(dǎo)后的菌液在相對分子質(zhì)量約為26 000處出現(xiàn)明顯目的條帶，未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液無相應(yīng)條帶，見圖2左。蛋白凝膠分析圖表明pET28a（＋）－P24蛋白表達(dá)量約占全菌體總蛋白的19%。電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)印到硝基纖維膜條。以抗His標(biāo)簽抗體作為第一抗體，HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體為第二抗體，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析，得到的特異性蛋白的相對分子質(zhì)量約為26 000，見圖2右。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a（＋）－p24的構(gòu)建

2.3 P24單克隆抗體效價及其特異性 將純化的P24蛋白包被于ELISA板，純化后單克隆抗體進(jìn)行梯度稀釋，ELISA檢測顯示抗體效價最高可達(dá)到30萬倍，具有較高的效價和良好的量效關(guān)系，見圖3。陰性對照孔吸光度值為0.136。將IPTG誘導(dǎo)的P24菌、未誘導(dǎo)菌作為陰性對照組，His標(biāo)簽蛋白作為陽性對照的3個樣品經(jīng)SDS－PAGE，轉(zhuǎn)印到硝基纖維膜條上，分別用P24單克隆抗體、His標(biāo)簽抗體及正常血清作為第一抗體，HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體為第二抗體進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果顯示P24單克隆抗體能夠特異性結(jié)合P24蛋白，具有很好的特異性，見圖4。

圖2 HIV－1P24重組蛋白的鑒定

圖3 HIV－1P24單克隆抗體的效價（ELISA）

2.4 ELISA法檢測艾滋病患者血清的病毒載量 應(yīng)用P24蛋白和制備的單克隆抗體建立競爭抑制ELISA法，首先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其結(jié)果顯示隨P24蛋白濃度的增加其吸光值逐漸降低，二者呈高度負(fù)相關(guān)，r2＝0.971 7，見圖5。應(yīng)用建立的ELISA方法檢測HIV－1陽性患者血清P24含量，并與逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測的患者血清病毒載量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明ELISA的吸光值與病毒載量也呈高度負(fù)相關(guān)（r2＝0.847 7），這些結(jié)果提示制備的單克隆抗體能有效識別病毒P24抗原，見圖6。

圖4 HIV－1P24抗體的特異性（Western blot）

圖5 HIV－1P24蛋白競爭抑制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 病毒載量與P24吸光值的相關(guān)曲線（ELISA）

3 討 論

目前臨床可用于檢測HIV感染并監(jiān)測疾病進(jìn)展的方法有HIV抗體檢測、P24抗原檢測、HIV核酸檢測以及T淋巴細(xì)胞計數(shù)?？偟膩碚f，ELISA檢測抗體和P24抗原的方法經(jīng)濟(jì)、省時。美國食品和藥物管理局規(guī)定自1995年8月起，所有全血、成分血、白細(xì)胞和原料血清的獻(xiàn)血員，在獻(xiàn)血前必須進(jìn)行HIV－1抗原的篩查。P24抗原更適合作為確定治療開始時間以及治療是否有效的標(biāo)志物。美國艾滋病臨床實(shí)驗(yàn)組認(rèn)為，血清P24濃度下降一半表明抗病毒治療有效，而P24濃度持續(xù)升高則表明缺乏有效治療［10］。

P24蛋白作為結(jié)構(gòu)基因gag的編碼產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)及其對機(jī)體的免疫作用機(jī)制已得到闡明，多種檢測方法已用于臨床，尤其是P24蛋白檢測試劑盒已得到廣泛應(yīng)用，但由于其檢出的假陽性率高，尚不能作為普查及評價艾滋病治療效果的檢測手段。本實(shí)驗(yàn)成功制備了P24抗原蛋白及其單克窿抗體，并對該抗體的效價及特異性進(jìn)行了檢驗(yàn)，結(jié)果顯示制備的單克隆抗體具有很高的特異性，通過建立的ELISA競爭法檢測HIV陽性的患者血清，并與檢測的病毒載量進(jìn)行相關(guān)性分析，證實(shí)二者具有顯著相關(guān)性，表明本課題組建立的HIV檢測法與PCR檢測的效果相當(dāng)，進(jìn)一步說明制備的單克隆抗體特異性和敏感性較高，P24蛋白及相應(yīng)的單克隆抗體可能為ELISA試劑盒檢測艾滋病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.衛(wèi)生部介紹中國艾滋病疫情現(xiàn)狀［EB／OL］.（2009－11－30）［2011－02－05］.http：／／www.moh. gov. cn／publicfiles／business／htmlfiles／mohbgt／s3582／200911／44754.htm.

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