楊 帆，胡 耑，白祥軍，李仁杰，張 錕，薛晨晨，曹 圓

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院創(chuàng)傷外科，湖北武漢430030）

臨床上，擠壓綜合征、壞死性筋膜炎等急性創(chuàng)傷可造成失控性炎癥反應，從而繼發(fā)全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、膿毒癥和多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）［1］，而負壓封閉引流（vacuum sealing drainage，VSD）可有效清除創(chuàng)面壞死組織和滲出液，已廣泛應用于各種急性創(chuàng)面的治療，臨床效果顯著［2－4］。但VSD減輕組織細胞炎癥反應的作用機制目前尚不明確。本實驗通過建立兔創(chuàng)面模型，研究VSD對創(chuàng)面局部組織巨噬細胞、中性多形核白細胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）、淋巴細胞、腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）和白細胞介素－6（interleukin－6，IL－6）的影響，探討VSD減輕創(chuàng)面炎癥反應的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器 VSD一次性護創(chuàng)材料為武漢維斯第公司產(chǎn)品、安舒妥傷口愈合快示格膠貼為英國施樂輝公司產(chǎn)品。TNF－α酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL－6檢測ELISA試劑盒均購自北京博奧森公司。主要儀器包括：便攜式負壓吸引儀（武漢維斯第公司）、Denley dragon wellscan MK3酶標儀、微量電動組織勻漿器（美國Kimble公司）及JT－12J全自動生物組織脫水機（武漢俊杰公司）等。

1.2 實驗動物 12只普通級健康日本大耳白兔，體質(zhì)量2.5～3.5kg，雌雄不限，由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK（鄂）－2008－0005－0007101。動物飼料由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院動物實驗中心提供。

1.3 動物建模與分組 用8%硫化鈉（天津恒興公司）于兔背部脫毛，3min后溫水洗凈并涂潤膚油保護皮膚，適應性喂養(yǎng)1周。建模前將規(guī)格為15cm×5cm的VSD輔料修剪為4塊備用，每塊大小為5cm×5cm。實驗兔稱體質(zhì)量后，采用30mg／kg鹽酸氯胺酮經(jīng)兔耳緣靜脈注射行兔全身麻醉，兔背部脫毛區(qū)予0.05%活力碘（武漢揚子公司）消毒，用手術刀全層切開皮膚直至肌肉層，形成一個2cm×2cm的創(chuàng)面，壓迫止血。將建模后的12只實驗兔隨機分為2組：（1）常規(guī)組（n＝6），創(chuàng)面消毒后不作特殊處理，僅每日常規(guī)換藥、包扎；（2）VSD組（n＝6），創(chuàng)面消毒后，乙醇脫碘，清除創(chuàng)緣污漬，采用膠貼貼膜后給予持續(xù)－125mmHg（－16.6kPa）負壓吸引，若存在引流管道漏氣或堵塞，則及時更換貼膜或VSD輔料。上述實驗兔均在特制飼養(yǎng)單籠中按標準條件進行飼養(yǎng)，防止創(chuàng)面污染及貼膜破損漏氣。

1.4 巨噬細胞、PMN及淋巴細胞檢測 建模后，VSD組和常規(guī)組實驗兔分別于1、2、3、4、5、6、7d在創(chuàng)緣處切取大小為3mm×5mm的組織，用4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋、切片，蘇木素－伊紅（hematoxylin－eosin，HE）染色。光學顯微鏡（日本Olympus公司）觀察并于600倍下隨機取5個視野，計算每個視野中巨噬細胞、PMN及淋巴細胞數(shù)量，結(jié)果以5個視野的平均值表示。將建模時切取的正常組織作為正常對照。

1.5 TNF－α和IL－6檢測 建模后，VSD組和常規(guī)組實驗兔分別于0.5、1.0、6.0、12.0h及1、3、5、7d在創(chuàng)緣處切取大小為2mm×2mm的組織，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌組織，稱質(zhì)量，－80℃保存待測。采用二辛可寧酸（bicinchoninic acid method，BCA）法進行蛋白定量，ELISA法檢測創(chuàng)面組織中TNF－α及IL－6含量。將建模時切取的正常組織作為正常對照。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 VSD組和常規(guī)組創(chuàng)面組織巨噬細胞、PMN及淋巴細胞的計數(shù) 建模前VSD組和常規(guī)組比較，創(chuàng)面組織巨噬細胞、PMN及淋巴細胞計數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。自1d時間點起兩組創(chuàng)面巨噬細胞及PMN計數(shù)均開始升高。VSD組創(chuàng)面巨噬細胞計數(shù)顯著高于常規(guī)組（P＜0.05），自6d時間點起兩組創(chuàng)面的巨噬細胞計數(shù)均開始下降，VSD組的創(chuàng)面巨噬細胞計數(shù)仍高于常規(guī)組（P＜0.01）。VSD組和常規(guī)組創(chuàng)面PMN計數(shù)分別在3d和4d時間點起開始下降，VSD組創(chuàng)面PMN計數(shù)持續(xù)低于常規(guī)組（P＜0.01）。自1d時間點起常規(guī)組創(chuàng)面淋巴細胞計數(shù)開始升高，自2d起開始下降，而VSD組的創(chuàng)面淋巴細胞計數(shù)于1d時間點時達峰值，然后持續(xù)下降且顯著低于常規(guī)組（P＜0.05）。見圖1、表1。

2.2 VSD組和常規(guī)組創(chuàng)面組織TNF－α及IL－6含量的變化建模前VSD組和常規(guī)組比較，創(chuàng)面組織TNF－α及IL－6含量的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。自0.5h時間點起兩組創(chuàng)面TNF－α及IL－6含量均開始升高。自1h時間點起VSD組創(chuàng)面TNF－α含量顯著低于常規(guī)組（P＜0.05），該組創(chuàng)面TNF－α含量在12h時間點時稍下降。兩組創(chuàng)面IL－6含量在12h時間點時稍有下降后上升，自12h時間點起VSD組創(chuàng)面IL－6含量顯著低于常規(guī)組（P＜0.05）。兩組創(chuàng)面 TNF－α、IL－6含量均于24h時間點達到峰值后開始下降。見表2。

表1 創(chuàng)面組織巨噬細胞、PMN及淋巴細胞的計數(shù) （ ±s，個）

表1 創(chuàng)面組織巨噬細胞、PMN及淋巴細胞的計數(shù) （ ±s，個）

△：為建模時；＊：P＜0.05，＃：P＜0.01，與常規(guī)組的相同細胞比較。

組別 n細胞計數(shù)時間點0△1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d VSD 組巨噬細胞 6 1.60±0.28 1.63±0.59＊ 1.90±0.34＊ 2.93±0.88＃ 3.17±0.44＃ 3.60±1.08＊ 4.33±0.70＃ 3.63±0.36＃PMN 6 1.13±0.49 1.33±0.42＊ 2.03±0.51＊ 3.03±0.64＊ 2.93±0.42＃ 2.47±0.49＃ 2.53±1.25＃ 2.43±0.54＃淋巴細胞 6 9.67±0.86 24.63±3.33 17.03±2.03＃ 14.93±4.15＃ 9.77±1.56＃ 8.14±0.94＃ 7.37±2.25＊ 3.73±1.47＃常規(guī)組巨噬細胞 6 1.53±0.32 1.40±0.46 1.80±0.59 2.57±1.05 2.70±0.36 3.47±0.69 3.93±0.54 3.13±0.43 PMN 6 1.10±0.19 1.43±0.34 2.17±0.51 3.30±0.27 3.97±0.67 3.67±1.33 3.13±0.81 2.93±0.55淋巴細胞 6 8.57±0.60 23.30±2.53 27.47±9.88 22.43±5.15 19.23±6.65 12.27±3.57 11.57±4.85 6.43±0.60

表2 創(chuàng)面組織TNF－α及IL－6含量的變化 （ ±s，pg·L－1）

表2 創(chuàng)面組織TNF－α及IL－6含量的變化 （ ±s，pg·L－1）

△：為建模時；＊：P＜0.05，＃：P＜0.01，與常規(guī)組的相同檢測指標比較。

組別 n檢測時間點0△0.5h 1h 6h 12h 1d 3d 5d 7d VSD 組TNF－α 6 18.74±4.94 51.72±19.52 140.78±63.77 202.22±93.05＊ 176.27±91.03＊ 198.56±86.09＊ 70.50±25.71＃ 70.06±37.63＃ 71.42±35.89＃IL－6 6 22.25±10.19 56.88±27.92 162.98±86.38＊242.11±136.48 200.45±89.37＊ 204.73±91.61＊ 74.28±39.94＃ 81.79±42.20＃ 78.60±47.39＃常規(guī)組TNF－α 6 18.78±4.46 49.78±8.70 126.56±25.37 231.11±34.29 244.95±64.06 250.18±48.15 243.21±60.84 228.60±42.18 155.01±31.46 IL－6 6 18.53±4.06 45.96±9.83 133.93±24.52 250.19±53.36 237.12±37.25 269.44±65.60 258.06±58.39 236.73±44.24 185.98±39.14

圖1 創(chuàng)面組織巨噬細胞、PMN及淋巴細胞形態(tài) （HE×600）

3 討 論

炎癥作為機體創(chuàng)傷后的基本防御性反應，通常包括早期的無菌性炎癥和后期的感染性炎癥。炎癥細胞和炎癥因子對炎癥結(jié)局具有決定作用。合并感染時，這些因子能與細菌脂多糖協(xié)同，刺激更多炎癥介質(zhì)的表達，從而放大和加重炎癥反應。臨床實踐表明VSD可顯著下調(diào)創(chuàng)面組織的炎癥反應，減少感染的發(fā)生，促進創(chuàng)面愈合。

本實驗發(fā)現(xiàn)VSD組創(chuàng)面的巨噬細胞計數(shù)顯著高于常規(guī)組，而VSD組創(chuàng)面PMN、淋巴細胞計數(shù)以及TNF－α、IL－6含量則持續(xù)低于常規(guī)組。其可能機制包括：（1）負壓刺激機體巨噬細胞和PMN向創(chuàng)面趨化。巨噬細胞和PMN均屬于吞噬細胞，在炎癥早期受趨化因子作用，可透過血管壁移行至組織損傷處，其主要功能是吞噬和殺滅病原體。巨噬細胞吞噬病原體或壞死組織后形成吞噬體，可存活數(shù)十天，而PMN殺死吞噬的病原體后，自身死亡成為膿細胞。當存在物理負壓刺激時，巨噬細胞和PMN加快向創(chuàng)面遷移和趨化，使治療初期VSD組創(chuàng)面的巨噬細胞和PMN較常規(guī)組多。由于PMN參與局部炎癥反應后其功能迅速降低，發(fā)生細胞凋亡或壞死，被巨噬細胞識別、吞噬，而巨噬細胞生存周期較長，使實驗表現(xiàn)為VSD組創(chuàng)面的巨噬細胞計數(shù)顯著高于常規(guī)組。同時，由于膿細胞增多，刺激巨噬細胞清除機體衰老及受損的炎癥細胞，進一步上調(diào)巨噬細胞功能，使其分泌多種細胞因子參與創(chuàng)面修復，調(diào)節(jié)免疫應答。若創(chuàng)傷發(fā)生時巨噬細胞表面的防御性受體受到下調(diào)，而效應性受體上調(diào)，將導致失控性炎癥反應的發(fā)生。（2）抑制細菌繁殖。創(chuàng)面貼膜使其與外界隔絕，可防止細菌侵入，減少病原微生物的定植和繼發(fā)感染的發(fā)生，從而降低免疫細胞增生、遷移和活化。同時，VSD形成的創(chuàng)面密閉、潮濕環(huán)境為巨噬細胞發(fā)揮吞噬功能提供有利條件，較傳統(tǒng)干燥創(chuàng)面更利于免疫細胞的游走和滲入，聯(lián)合持續(xù)引流可直接清除病原體［5－7］。（3）下調(diào)炎癥反應。VSD可減少創(chuàng)面TNF－α及IL－6分泌，促進浸潤的淋巴細胞消退。巨噬細胞和PMN是非特異性免疫應答反應中的主要效應細胞，其作用不僅限于吞噬與殺菌，而且能合成、分泌多種細胞因子參與炎癥反應。PMN壞死而被吞噬可避免胞內(nèi)炎癥物質(zhì)釋放，從而局限炎癥范圍，下調(diào)巨噬細胞和PMN的上、下游炎癥反應。當炎癥反應控制后，創(chuàng)面TNF－α、IL－6含量和淋巴細胞計數(shù)下降。TNF－α是促炎癥反應的主要效應分子［8］，能通過激活核轉(zhuǎn)錄因子抑制PMN的凋亡，加重炎癥反應［9－10］；IL－6可由多種細胞合成和釋放，通過刺激血小板活化因子而協(xié)同TNF－α放大炎癥反應或抑制PMN的凋亡［11－12］。當各種原因造成細胞凋亡延遲或障礙時，細胞存活時間延長，細胞數(shù)量和刺激性產(chǎn)物增多，一旦壞死，將導致持續(xù)、劇烈的炎癥反應和組織損傷［13－14］。

目前大部分研究認為，VSD通過改善創(chuàng)面血流、消除水腫及上調(diào)生長因子表達等途徑促進創(chuàng)面的修復［2－4，15］。本研究觀察到物理負壓可活化巨噬細胞，減少炎癥介質(zhì)TNF－α及IL－6的分泌，預防過度炎癥反應的發(fā)生，對完善VSD理論具有一定的指導意義。

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