牛曉昶，曾照芳，賈 佳，李艷林，夏 季，黃恒柳，鄧少麗△

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗(yàn)科，重慶400042；2.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 400014）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）簡(jiǎn)稱紅斑狼瘡，是由多克隆自身反應(yīng)性B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，B細(xì)胞異常激活并異常分化為漿細(xì)胞和記憶性效應(yīng)細(xì)胞，其直接的致病因子是多克隆自身抗體，并以免疫復(fù)合物的形式造成多種組織器官損傷。雖然目前對(duì)于引起SLE的確切病因仍不明確，但是SLE中異常漿細(xì)胞分泌多種致病性自身抗體導(dǎo)致SLE的發(fā)生已成共識(shí)，這些抗體主要來(lái)源于漿細(xì)胞。漿細(xì)胞存活及其抗體分泌功能主要由B淋巴細(xì)胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）調(diào)控，雖然BCMA作用的相關(guān)機(jī)制至今尚未完全清楚，但是已有研究顯示BCMA在漿細(xì)胞的存活中發(fā)揮重要作用［1］。因此，阻斷BCMA可選擇性抑制漿細(xì)胞的存活，減少抗體的分泌，BCMA成為治療SLE的潛在靶點(diǎn)。白細(xì)胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）138是漿細(xì)胞特異的膜抗原，是成熟漿細(xì)胞的標(biāo)記。本研究從BCMA蛋白維持漿細(xì)胞存活的角度出發(fā)，探討B(tài)CMA表達(dá)和CD138＋漿細(xì)胞數(shù)量在SLE患者和健康人體內(nèi)存在的差異，為研究SLE的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 主要試劑包括：人BCMA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司，F(xiàn)icoll細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)GE公司，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品，焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）原液為Sigma公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real time－polymerase chain reaction，RTPCR）試劑盒購(gòu)自Promega公司?？笴D138－藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、CD38－異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、CD19－FITC、CD45－藻紅蛋白－花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PC5）、CD56－PE、IgG1－PE／IgG1－FITC／IgG1－PC5抗體均購(gòu)自BECKMAN公司，Taq酶購(gòu)自Promega公司。主要儀器包括：CFX－96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio－Rad公司）、ND－1000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Nanodrop公司）、流式細(xì)胞儀（美國(guó)Backman公司），MK3酶標(biāo)分析儀（芬蘭雷勃公司）。

1.2 材料 選擇2009年4月至2011年6月于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院就診的40例臨床確診的SLE患者作為SLE組，均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡15～54歲，平均（34.0±6.0）歲。將同期進(jìn)行健康體檢的30例健康人作為對(duì)照組，年齡26～49歲，平均（35.0±5.0）歲。取上述患者及健康人的靜脈血進(jìn)行研究，采集的血液標(biāo)本用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝。

1.3 引物 BCMA 引物：上游5′－GCA TCA AGA GCA AAC CGA AGG－3′，下游5′－TCT ATC TCC GTA GCA CTC AAA GC－3′；BCMA 熒光探針：FAM－5′－CGA CTC TGA CCA TTG CTT TCC ATC CCC A－3′。B2 M 引 物：上 游 5′－TCC ATC CGA CAT TGA AGT TGA C－3′，下 游 5′－ACT ATC TTG GGC TGT GAC AAA G3′；B2 M 探 針：FAM－5′－TGG TTC ACA CGG CAG GCA TAC TCA－3′。上述引物和熒光探針均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.4 ELISA法檢測(cè) BCMA （1）包被：以 PBS將72μg／mL捕獲抗體稀釋至終濃度為0.4μg／mL，將其加入空白微孔板（100μL／孔），室溫過(guò)夜，0.05%Tween20洗滌液洗板3次，甩干；（2）封閉：以試劑稀釋劑（含1%牛血清清蛋白的PBS液）封閉微孔，每孔300μL，室溫放置至少1h，0.05%Tween20洗滌液洗板3次，甩干，備用；（3）加樣：以試劑稀釋劑稀釋重組人BCMA標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)倍稀釋，稀釋后終濃度為31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00、2 000.00pg／mL，將其 分 別加入100μL標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)血清，室溫放置2h，以0.05%Tween20洗滌液洗板3次，甩干；（4）加入生物素化羊抗人BCMA抗體：以試劑稀釋劑將36μg／mL檢測(cè)抗體稀釋至終濃度為200ng／mL，每孔100μL，室溫放置2h，0.05%Tween20洗滌液洗板3次，甩干；（5）加入鏈霉親和素－辣根過(guò)氧化物酶（streptavidin－h(huán)orseradish peroxidase，SA－HRP）：SA－HRP以試劑稀釋劑按1∶200稀釋后加入微孔中，每孔100μL，避免強(qiáng)光直射，放置室溫20min，以0.05%Tween20洗滌液洗板3次，甩干；（6）顯色、測(cè)定：每孔加入顯色劑A和顯色劑B各50μL，避免強(qiáng)光直射，放置室溫20min后加入終止液50μL，在酶標(biāo)儀上讀取450nm處光密度（optical density，OD）值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣本的BCMA含量。

1.5 單個(gè)核細(xì)胞RNA的提取 用Ficoll細(xì)胞分離液通過(guò)離心（離心半徑9cm，2 000r／min離心20min），將標(biāo)本中的單個(gè)核細(xì)胞分離出來(lái)，用1%PBS洗滌，然后再離心（2 500r／min離心10min），去上清液，留單個(gè)核細(xì)胞于管底。用Trizol破裂細(xì)胞，氯仿、異丙醇和75%乙醇萃取、沉淀，提取細(xì)胞RNA，將RNA溶解在無(wú)核酸酶水中，測(cè)定其濃度和純度，為不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，濃度應(yīng)不小于300ng／μL，A260／A280不小于2.0。根據(jù)RT－PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)取1mg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 熒光定量RT－PCR檢測(cè) 反應(yīng)體系：Free water 3.4μL、Mix混合液5.0μL、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、BCMA探針0.3μL、Taq酶0.2μL、cDNA 0.5μL、總體積10.0μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min后，95℃變性10s，58℃退火30s，共45個(gè)循環(huán)。計(jì)算的周期閾值（cycle threshold，Ct），根據(jù)相對(duì)定量2－ΔΔCt法計(jì)算SLE組和對(duì)照組靜脈血BCMAmRNA的差異。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 將兩組標(biāo)本在Ficoll細(xì)胞分離液的作用下離心（離心半徑9cm，2 000r／min離心20min），收集單個(gè)核細(xì)胞，用1%PBS洗滌。將 CD138－PE、CD38－FITC、CD19－FITC、CD45－PC5、IgG1－PE／IgG1－FITC／IgG1－PC5熒光抗體標(biāo)記的單 個(gè) 核 細(xì) 胞 分 為 3 組：（1）CD38－FITC、CD138－PE 及CD45－PC5標(biāo)記細(xì)胞組；（2）CD19－FITC、CD138－PE 及 CD45－PC5標(biāo)記細(xì)胞組；（3）IgG1－PE／IgG1－FITC／IgG1－PC5及 CD45－PC5標(biāo)記細(xì)胞組。3組細(xì)胞均孵育1～2h后上機(jī)檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，組間差異的比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清ELISA檢測(cè)分析 SLE組患者血清BCMA水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 SLE患者與健康者血清BCMA水平的比較

2.2 熒光定量RT－PCR分析 經(jīng)45次循環(huán)，熒光定量RTPCR反應(yīng)曲線見(jiàn)圖1。SLE組患者的ΔCt值明顯高于對(duì)照組的ΔCt值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SLE組為0.811，對(duì)照組為1.716。經(jīng)2－ΔΔCt法計(jì)算（－ΔΔCt＝SLE組－對(duì)照組），SLE組患者BCMA基因的含量是對(duì)照組的1.873倍，見(jiàn)圖2。

圖1 熒光定量RT－PCR反應(yīng)曲線

圖2 SLE組和對(duì)照組的ΔCt分布情況和ΔCt值

圖3 SLE組（左）和對(duì)照組（右）患者的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，SLE組患者靜脈血漿細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，見(jiàn)圖3。

3 討 論

BCMA為B細(xì)胞表面分子，是由184個(gè)氨基酸殘基組成的非糖基化單鏈Ⅰ型蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）家 族，是 Ⅰ 型 跨膜受體［2］。BCMA 表達(dá)于 B細(xì)胞的生發(fā)中心［3］、成熟 B細(xì)胞［4－5］以及成熟漿細(xì)胞 表 面［1，6］。B 細(xì) 胞 激 活 因 子 （B cell activating factor，BAFF）是B細(xì)胞產(chǎn)生、發(fā)育和自身反應(yīng)所必需［7－9］。BCMA可與BAFF配體相結(jié)合，其可能機(jī)制是BCMA與BAFF蛋白結(jié)合，使抗凋亡基因Bcl－2、Mcl－1的表達(dá)上調(diào)，維持漿細(xì)胞生長(zhǎng)，成為長(zhǎng)壽漿細(xì)胞，從而增加成熟漿細(xì)胞的數(shù)量及其抗體的分泌［9］。在自身免疫疾病患者，尤其是SLE患者體內(nèi)可檢測(cè)出高水平的BAFF［10－11］，因此，在維持漿細(xì)胞的存活中BCMA 發(fā)揮了重要的作用。BCMA基因位于16p13，mRNA全長(zhǎng)約1.2kb［12］。人類漿細(xì)胞、生發(fā)中心 B淋巴細(xì)胞［3］以及小鼠漿細(xì)胞的BCMA表達(dá)明顯升高，其缺失會(huì)縮短骨髓長(zhǎng)壽漿細(xì)胞生存時(shí)間［1］。分析B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)BCMA隨著B(niǎo)細(xì)胞的發(fā)育成熟而出現(xiàn)，其表達(dá)量逐漸增加，且只表達(dá)于成熟B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞，為維持漿細(xì)胞存活所必需，在B細(xì)胞發(fā)育的時(shí)空性上具有一致性［13］。BCMA雖在生發(fā)中心B細(xì)胞中表達(dá)，但它對(duì)外周B細(xì)胞的數(shù)量、各種外周B細(xì)胞亞型的分布以及B細(xì)胞的壽命沒(méi)有明顯影響，在成熟B細(xì)胞分化到漿細(xì)胞階段，其BCMA表達(dá)較多，BCMA可能與調(diào)控漿細(xì)胞存活及抗體分泌功能有關(guān)。漿細(xì)胞是致病性自身抗體的直接來(lái)源，40%自身抗體分泌性漿細(xì)胞是長(zhǎng)壽命的，長(zhǎng)壽漿細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體可反復(fù)激活潛在的病理免疫應(yīng)答反應(yīng)［14］。BCMA基因剔除小鼠有正常的脾結(jié)構(gòu)，B細(xì)胞發(fā)育正常，T細(xì)胞非依賴性免疫反應(yīng)和T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)未見(jiàn)明顯異常，但漿細(xì)胞數(shù)量明顯減少，這又證明BCMA在維持漿細(xì)胞存活中的重要性［1］。

CD138＋能特異性地標(biāo)記成熟漿細(xì)胞，本研究利用這一特征對(duì)SLE組和對(duì)照組靜脈血的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，比較兩組CD138＋漿細(xì)胞數(shù)量的差異。本研究將熒光定量RT－PCR技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)及ELISA結(jié)合，研究維持漿細(xì)胞存活的重要因子BCMA。其結(jié)果顯示SLE組血清BCMA明顯高于對(duì)照組，SLE組體內(nèi)BCMA基因表達(dá)的相對(duì)量是對(duì)照組的1.873倍，且流式細(xì)胞術(shù)顯示SLE組患者靜脈血CD138＋漿細(xì)胞的數(shù)量也明顯高于對(duì)照組，提示在SLE患者體內(nèi)BCMA基因高表達(dá)，SLE患者體內(nèi)漿細(xì)胞數(shù)量的增加與BCMA高表達(dá)相關(guān)，這為進(jìn)一步了解SLE發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，為SLE治療提供了新的方向和靶點(diǎn)。

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