王曉菲

顳頜關(guān)節(jié)病 （temporomandibular disorders，TMD）是人群中的一種常見病和多發(fā)病，治愈率低，病因復雜，臨床表現(xiàn)為一系列顳頜關(guān)節(jié)及附近組織疼痛、張口受限等癥狀，嚴重影響患者的生存質(zhì)量[1]。研究表明，SP廣泛分布于 TMJ（temporomandibuar joint）中，與TMJ病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。與包括關(guān)節(jié)軟骨在內(nèi)的各種骨代謝有密切的關(guān)系[3，4]。目前，TMJ內(nèi)SP的相關(guān)應研究多為定性研究，缺乏明確的定量研究來觀察應激后TMJ內(nèi)SP的變化。因此，本研究在建立應激動物模型，通過定量觀察應激前后TMJ內(nèi)SP相關(guān)神經(jīng)肽的變化，探討應激因素與TMD的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠，一級，60只，體重（150±10）g，雄性，由山東大學動物中心提供。

1.2 儀器與設備 隨機應激儀，自制，裝置分為兩部分即刺激儀和刺激籠。刺激儀在結(jié)構(gòu)上由隨機發(fā)生器和輸出電路組成。隨機發(fā)生器由2個震蕩器形成隨機組合的脈沖，經(jīng)延時后控制連續(xù)波發(fā)生器，后者產(chǎn)生4 Hz的連續(xù)頻率，它的持續(xù)時間即刺激時間可在2、5、10 s內(nèi)選擇，隨機形成的連續(xù)波經(jīng)輸出電路輸出，輸出脈沖的空載幅度為150 V。

1.3 實驗動物分組和方法 將60只大鼠分為空白對照組、電擊組（foot-shocked，F(xiàn)S）、應激組（emotional stress，ES）和藥物對照組（anti-anxiety-drug，AAD）15只/組。以上各組又隨機分為10、20、30 d三個亞組，5 只/組。

1.4 建模 模型建立時參考Rosales等[5，6]的模型。電擊組：每天固定時間給予電擊，30 min/d，電壓80 V，應激頻率4 Hz，以維持受刺激動物驚恐、緊張和憤怒的應激狀態(tài)。應激組：電擊組受電擊后排便，豎毛，尖叫等反應影響該組大鼠。藥物對照組：試驗前30 min給抗焦慮抑郁注射液注射量為1 mg/kg。空白對照組：不給予以上應激影響。各組大鼠的體重、性別通過均衡檢驗，證實無顯著性差異。各組大鼠均為普通固體飼料，自由飲水，同等飼養(yǎng)。實驗開始前1周，將大鼠放入交流箱中適應一段時間，不給予應激。應激時間設置為10 d組、20 d組和30 d組。其中電擊組大鼠僅作為應激源，不參與實驗測試。藥物對照組與應激組大鼠一樣，同期、同樣的條件下開始實驗，但藥物對照組大鼠在實驗前30 min皮下注射抗焦慮抑郁藥。每天上午的固定時間給予應激，以嚴格對照，保證研究結(jié)論的可靠性。

1.5 RT-PCR 取大鼠髁突，將髁突液氮處理并研磨。常規(guī)方法提取收集TMJ髁突軟骨組織的總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），采用反轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核（Complementary deoxyrlibonucleic acid，cDNA）合成試劑盒合成cDNA，設計引物序列進行RT-PCR擴增，β-actin用做內(nèi)定參考。

引物設計如下：SP （252bp） 上游：5’-GAG CCCTT TGA GCAT CTTCT-3’； 下 游 ：5’-ACG CCTTCTTTCGTAGTTCTG-3’。β-actin （422bp）上游：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’；下游：5’-TCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3’。

PCR 擴增：PCR 反應總體積 25 μl， 包括：PCR Mix 10 μl， 上、 下游引物共 1 μl，cDNA 模板 2 μl，H2O 12 μl。 PCR 條件為 95℃預變性 5 min，94℃變性 1 min，58℃和 56℃退火 1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后，最后一個循環(huán)72℃ 10 min。

取 SP 及 β-actin，擴增產(chǎn)物各 5 μl，混合后 2%瓊脂糖凝膠電泳1 h。RT-PCR電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)的分析軟件進行量化處理，用β-actin作內(nèi)參照，對SP基因表達的相對量進行分析。用SPSS15.0軟件單因素方差分析對實驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 實驗中，F(xiàn)S組大鼠有跳躍，翹尾，豎毛等行為表現(xiàn)，ES組大鼠有豎毛、恐慌等應激行為表現(xiàn)。藥物對照組沒有豎毛、恐慌等應激表現(xiàn)。各組取材時，同性別大鼠平均體重相似。各組大鼠無意外死亡。

2.2 SPRT-PCR結(jié)果 以β-actin擴增產(chǎn)物作為內(nèi)參照進行半定量分析：ES組SPmRNA的表達量最高，AAD組和對照組SPmRNA的表達量較低。統(tǒng)計結(jié)果顯示，ES組、AAD組和對照組均有顯著差異（P<0.05），AAD 組與對照組無顯著性差異（P>0.05）。

10 d時，ES組SP表達最高。AAD組神經(jīng)肽分子的表達略有升高，各組比較均有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。20 d時，ES組相比10 d時顯著降低 （P<0.05），高于對照組與AAD組；AAD組相比10 d水平顯著降低 （P<0.05），與對照組無顯著差異 （P>0.05）。30 d時ES組和AAD組SP的表達水平顯著低于10 d與20 d（P<0.05），與對照水平無顯著差異（P>0.05）。

圖1 SPRT-PCR檢測結(jié)果圖

3 討 論

TMD指發(fā)生在TMJ 區(qū)及相應的軟組織的一類以肌肉的疼痛、異常關(guān)節(jié)音及下頜運動異常和伴有功能障礙為主要特征的一組疾病的總稱，其在人群中的發(fā)病為20%～40%，是口腔醫(yī)學臨床最常見的疾病之一[7]。該病的病因比較復雜，對其病因和發(fā)病機理的研究表明，TMD是多種因素作用的結(jié)果，尤其與患者的情緒抑郁、環(huán)境壓力有著密切的關(guān)系，應激因素對該病的發(fā)生、發(fā)展及預后有著重要的影響[8，9]。

20世紀50年代Schwartz等[10]報道了TMD與心理因素有關(guān)，此后關(guān)于應激對口頜系統(tǒng)健康的影響乃至其在口頜肌功能紊亂、TMJ疼痛的發(fā)生、發(fā)展和治療效果方面的研究時有報道[10-13]，但迄今仍沒有確鑿的證據(jù)證明兩者之間存在直接因果關(guān)系。本研究參考了Rosales等[5，6]的應激模型，并在此基礎上證實了應激對TMJ具有一定的影響。

SP具有促進肥大細胞脫落，釋放組胺及5羥色胺等各種傷害性刺激因子，誘導滑膜細胞中DNA和蛋白質(zhì)的合成與分裂作用[14]。能與已知的滑膜細胞的另兩種刺激因子白細胞介素-1和腫瘤壞死因子有相互作用，共同發(fā)揮對滑膜細胞的作用。如壓力、精神緊張和炎癥介質(zhì)等，都能激活傷害感受器引起SP合成和釋放增加。本文結(jié)果提示在應激因素引起的TMJ病變過程中的初期，SP合成和釋放增加，會對表面滑膜細胞產(chǎn)生作用，致使表層膠原纖維的破壞；隨著應激時間的延長，動物對應激的慢慢適應，SP合成和釋放減少，癥狀可能會有所減輕。

本文結(jié)果說明應激對TMJ的影響可能是體內(nèi)多種相關(guān)神經(jīng)肽分子變化的作用?？蔀轭A防和治療與應激相關(guān)的TMD提供理論依據(jù)?？蔀檫M一步闡明心理因素與TMD的關(guān)系提供了理論依據(jù)，對臨床雙軸診斷和治療具有一定的理論指導義意。

[1]XU Weihua,MA Xuchen,GUO Chuanbin,et al.Psychological status in patients with temporomandibular disorders[J].Chinese Journal of Stomatology,2005,40（5）:359-361.

[2]Kido MA,Kiyoshima T,Kondo T,et al.Distribution of substance P and calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive nerve fibers in the rat temporomandibu-lar joint[J].J Res,1993,72(6):592-598.

[3]Sun Yingming,Duan Yinzhong,Fan Chengtao.Effect of SP on intracellular free calcium concentration in cultured osteoblast[J].Chinese Journal of Stomatology,2001,36（6）:408-411.

[4]Konttinen Y,Imai S,Suda A.Neuropeptides and the puzzle of bone remodeling[J].Acta Orthop Scan,1996,67（6）:632-639.

[5]Rosales VP,Ikeda K,Hizaki K,et al.Emotional stress and bruxlike activity of the masseter muscle in rats[J].Eur J Orthod,2002,24（1）:107-117.

[6]Funada M,Hara C.Differential effects of psychological stress on activation of the 5-hydroxytryptamine and dopamine-containing neurons in the brain of freely moving rats[J].Brain Res,2001,901(3):247-251.

[7]Nicholson RA,Townsend DR,Gremling SE.Influenec of a scheduled-waiting task on EMG reactivity and oral habit among facial pial patients and no-pain concrols[J].Appl-Psychophysiol-Biofeed-back,2000,25（4）:203-19.

[8]Jager K,Schneider M.How do occlusion disorder and stress influence cybernetic masticatory control?[J]Schweiz Monatsschr Zahnmed,1992,102（5）:536-540.

[9]Schwartz LL.Pain associated with the temporomandibular joint[J].The Journal of the American Dental Association,1955,51(4):394-397.

[10]Goddard G，Karibe H．TMD prevalence in rural and urban Native American populations[J]．Cranio，2002，20（2）：125-128．

[11]Molin C．From bite to mind TMD-a personal and literature review[J]．Int J Prosthodont,1999,12（3）：279-288．

[12]Suvinen TI，Reade PC，Kemppainen P，et al．Review of aetiological concepts of temporomandibular pain disorders：towards a biopsychosocial model for integration of physical disorder factors with psychological and psychosocial illness impact factors[J].Eur Pain,2005,9（6）：613-633．

[13]Tsai CM,Chou SL,Gale EN,et al.Human masticatory muscle activity and jaw position under experimental stress[J].J Oral Rehabil,2002,29（1）:44-517.

[14]Cruwys SC.Sensory denervation with capsaicin attenuates inflammationand nociceptionin arthritic rats[J].Neurosci Lett,1995,67(3):235-243.