劉相 呂翠環(huán) 李玉靜 杜月菊 陳海峰

近幾年來，隨著耐藥結(jié)核菌逐漸增多，傳統(tǒng)的結(jié)核桿菌藥物敏感試驗耗時長，不利于結(jié)核患者的早期有效的治療。盡管目前有一些快速檢測結(jié)核菌藥物敏感性的方法，但由于儀器和試劑昂貴或者技術(shù)復(fù)雜很難推廣。我們利用CLSI(NCCLS)M24-A微量肉湯稀釋法原理，通過縮短藥敏試驗的時間，縮短整個結(jié)核菌培養(yǎng)及藥敏試驗的時間，達到快速檢測患者的耐藥情況，以便及時指導(dǎo)臨床用藥。本文隨機選擇100例患者分別采用快速實驗及傳統(tǒng)藥敏試驗方法進行對照。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 試驗組和對照組分別隨機抽取50例。試驗組男38例，女12例;年齡9～84歲，平均年齡40歲。對照組男27例，女23例;年齡13～78歲，平均年齡32歲。標(biāo)本來源:痰液、氣管鏡灌洗液、針吸物、胸水、手術(shù)標(biāo)本等。

1.2 方法

1.2.1 2組采用同樣的方法進行前期的處理和培養(yǎng)。藥敏試驗試驗組接種在快速藥敏培養(yǎng)基，對照組接種在傳統(tǒng)的羅氏藥敏培養(yǎng)基?？焖偎幟襞囵B(yǎng)基及快速藥敏試驗肉湯培養(yǎng)基均由試劑廠家提供，改良羅-氏培養(yǎng)基及傳統(tǒng)藥敏用培養(yǎng)基均由本科室按結(jié)核病診斷細菌學(xué)檢驗規(guī)程自制?？焖偎幟魧嶒灥脑?根據(jù)CLSI(NCCLS)M24-A微量肉湯稀釋法原理，將藥物包括菌群分類藥物事先包被在U-底板上，將結(jié)核菌研磨比濁，以培養(yǎng)基稀釋后加入測試孔，根據(jù)各孔的情況獲得MIC數(shù)據(jù)成界值范圍，以此判斷藥物敏感性。

1.2.2 培養(yǎng):研究病例均以晨痰用4%NaOH液消化15 min，PBS緩沖液平衡離心，取沉淀物分別接種于BD公司生產(chǎn)的液體快速結(jié)核菌培養(yǎng)基及改良羅氏培養(yǎng)基，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)獲得，快速培養(yǎng)基報陽經(jīng)涂片確認，羅氏培養(yǎng)基經(jīng)2～8周出現(xiàn)菌落涂片確認為分支桿菌。

1.2.3 藥敏試驗:凡培養(yǎng)陽性者均做統(tǒng)一抗結(jié)核藥物藥敏試驗。試驗組:常用藥物及濃度:鏈霉素(Sm):1、2、4、8 μg/ml;異煙肼(Inh):0、2、0.4、0.8、1.6 μg/ml;利福平(Rfp):1、2、4、8 μg/ml;乙胺丁醇(Emb):2、4、8、16 μg/ml;氧氟沙星(Ofx):2、8 μg/ml;左氧氟沙星(Lfx):2、8 μg/ml;阿米卡星(Am):1、4 μg/ml;卷曲霉素(Cm):2.5、10 μg/ml;丙硫異煙胺(Pto):10、40 μg/ml;力克肺疾(Dpc):0.5、2 μg/ml;莫西沙星(Mfx):0.5、2 μg/ml，環(huán) 丙 沙 星 (Cip):1、4 μg/ml;克 拉 霉 素 (Cir):4、16 μg/ml;利福布丁(Rfb):0.75、3 μg/ml;利奈唑胺(Lz):2、8 μg/ml;氯法齊明(Cio):0.5、2 μg/ml。用于菌型鑒定藥物濃度為:TCH C2—羧酸肼噻吩0.25 μg/ml，PNB對硝基苯甲酸400 μg/ml。對照組:常用藥物及濃度:Sm:10、100 μg/ml;Inh:1、10 μg/ml;Rfp:50、250 μg/ml;Emb:5、50 μg/ml;對氨基水楊酸鈉(Pas):1、10 μg/ml;Dpc:1、10 μg/ml;LFV:2、20 μg/ml。藥物來源均由住院藥房提供，與患者用藥一致。用于菌型鑒定的培養(yǎng)基及濃度為:C2—羧酸肼噻吩(TCH)100 μg/ml)，對硝基苯甲酸(PNB)500 μg/ml。

2 結(jié)果

2.1 獲得結(jié)果的時間 試驗組大部分接收標(biāo)本以后20～30 d可以獲得藥物敏感實驗結(jié)果，平均26.3 d，其中小于20 d，對照組大部分在50 d以上，30 d以內(nèi)未獲得藥物敏感實驗結(jié)果。見表1。

表1 2種不同方法獲得結(jié)果的時間分布 n=50，例

2.2 耐單藥分布 試驗組在藥物的組合上比對照組多了6種，對于耐藥結(jié)核菌而言尤其有意義，藥物濃度也發(fā)生改變，比對照組的藥物類型多，而且濃度由原來的2種，變成4種，有利于藥物的選擇。見表2。

表2 2種不同方法試驗藥物分布 n=50，種

3 討論

經(jīng)典“慢培”方法依靠雞卵為基礎(chǔ)的固體表面培養(yǎng)技術(shù)，如羅氏、Ogawa等培養(yǎng)基。其優(yōu)點是成本低，能分離到單個菌落，通過菌落形態(tài)的觀察鑒定細菌。缺點是生長緩慢，周期長，平均49.6 d，最快42 d，藥敏試驗需要4周時間?！翱炫唷狈椒?以BD公司BACTEC MGIT960為代表的以液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)結(jié)合儀器信號捕獲的快速分離培養(yǎng)，獲得生長數(shù)據(jù)。分離周期短，結(jié)核分枝桿菌的平均檢出時間為26.3 d，最快18 d，快速藥敏試驗培養(yǎng)平均檢測時間一般為7～14 d，比羅氏早2～3周。

快速藥敏試驗培養(yǎng)7～14 d出結(jié)果，傳統(tǒng)藥敏試驗培養(yǎng)4周出結(jié)果。以BD公司 BACTEC MGIT960為液體培養(yǎng)基的結(jié)核菌培養(yǎng)縮短了培養(yǎng)的時間，以CLSI(NCCLS)M24-A肉湯培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的增菌培養(yǎng)基的結(jié)核分枝桿菌快速分離培養(yǎng)技術(shù)縮短了藥敏試驗的培養(yǎng)時間。BD公司BACTEC MGIT960為液體培養(yǎng)技術(shù)及結(jié)核分枝桿菌快速分離培養(yǎng)技術(shù)在實驗室的應(yīng)用，縮短了結(jié)核菌的培養(yǎng)及藥敏試驗的時間，使結(jié)果更快速準確，更及時的服務(wù)于臨床，對患者的治療，起到積極的作用。

通過對兩種試驗方法的比較，可以看出，試驗組比傳統(tǒng)對照組藥敏試驗時間明顯縮短，對于難治性肺結(jié)核患者尤其重要，可以在短時間內(nèi)指導(dǎo)臨床及對患者的用藥規(guī)范，使患者盡快恢復(fù)健康。常用藥物只有2種藥物濃度，而快速藥敏試驗對于常用藥物增加了藥物的濃度，常用藥物增至4個藥物濃度，更精確。該方法為CLSI(NCCLS)推薦的M24-A標(biāo)準微量肉湯稀釋法(Microbroth Dilution Method)藥敏試驗方法，需要的菌量少，速度快，數(shù)據(jù)全，7～14 d內(nèi)提供16種藥物藥敏及分群鑒定數(shù)據(jù)，使合理用藥成為現(xiàn)實。