柴 燕，趙新宇，周 杰

(南匯出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 201300)

蜂蜜是我國傳統(tǒng)出口商品，并在世界上享有盛譽(yù)，但是我國蜂產(chǎn)品出口隱患并不少，蜂產(chǎn)品的質(zhì)量安全也倍受關(guān)注，其抗生素殘留控制已成為各國食品安全工作的重要部分之一［1］。在養(yǎng)蜂業(yè)中抗生素是用來防治蜜蜂細(xì)菌病的常用藥物，而近些年來，藥物殘留問題嚴(yán)重影響了我國的蜂產(chǎn)品出口貿(mào)易［2－4］。歐盟、美國、日本等進(jìn)口國對蜂蜜中的獸藥殘留提出了嚴(yán)格的限量要求，這使我國蜂蜜出口一度受阻，下降到歷史最低點(diǎn)［5－6］。如何做到科學(xué)養(yǎng)蜂、合理用藥已刻不容緩［7－9］。本實(shí)驗(yàn)通過對蜂群分別施用鏈霉素和土霉素后連續(xù)跟蹤采樣進(jìn)行藥殘含量檢測，進(jìn)行分析得出兩種藥物殘留在蜂產(chǎn)品中的休藥期，以指導(dǎo)蜂農(nóng)合理用藥［10－11］。

1 材料與方法

1．1 材料 鹽酸土霉素(98．5%)，美國Sigma公司;硫酸鏈霉素(99．0%)，美國 Sigma公司;土霉素、鏈霉素酶聯(lián)免疫試劑，德國R－Biopharm公司。

1．2 儀器與設(shè)備 臺式高速冷凍離心機(jī)，Thermo Scientific公司;多功能酶標(biāo)檢測儀及其軟件SynergyTM，Bio－Tek公司;HP－5016SY氮?dú)獯蹈蓛x，上海濟(jì)成分析儀器有限公司。

1．3 方法

1．3．1 樣品的準(zhǔn)備

1．3．1．1 選群 選擇群勢強(qiáng)且相當(dāng)?shù)?箱蜂作為試驗(yàn)用蜂群，并準(zhǔn)確定群。每種藥物用2箱蜂，做平行對照試驗(yàn)。

1．3．1．2 給藥 在花期前1周，按每10足框蜂加鏈霉素、土霉素各600 mg，分3次飼喂，每次200 mg，隔2 d給藥一次。

1．3．1．3 采樣與保存 在第3次給藥后，每3天采樣一次，連續(xù)10次;然后每5天采樣一次，連續(xù)6次。每次作好標(biāo)簽，置于4℃冰箱內(nèi)保存待測。采集樣品時(shí)，取第1樣與第2樣應(yīng)對取樣桶、器具進(jìn)行清洗。

1．3．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 根據(jù)試劑盒說明，將試劑盒中鏈霉素、土霉素各標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別稀釋6倍，測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對抗體的抑制率，以相對吸光度B/B0(各相應(yīng)濃度的藥物抑制時(shí)的OD450nm值為B值，不加藥物抑制時(shí)的OD450nm值為B0)為縱坐標(biāo)，以不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并推導(dǎo)出回歸方程，進(jìn)行相關(guān)回歸分析。

1．3．3 前處理方法 含鏈霉素蜂蜜的前處理方法:準(zhǔn)確稱取1．0 g蜂蜜樣品，加入9 mL提取緩沖液，室溫下混合10 min。將此溶液以3000 g離心10 min。用RIDA C18柱純化提取物:以2 mL甲醇(100%)和2mL蒸餾水洗滌柱子，流速為1滴/s;取樣品上清液過柱，10滴/min;再以3 mL蒸餾水洗柱，正壓去除殘留液體并且用空氣或氮?dú)獯?分鐘干燥柱子;用2 mL甲醇(100%)洗脫樣品，流速為10滴/min;在40～50℃用弱空氣或氮?dú)饬魍耆珦]發(fā)溶劑;用10 mL PBS緩沖液溶解干燥的殘留物，即10倍稀釋，待用。

含土霉素蜂蜜的前處理方法:用80 mL的帶蓋玻璃瓶準(zhǔn)確稱取1．0 g蜂蜜樣品，用PBS緩沖液(pH 7．4，20 mM)稀釋 20倍。將此溶液超聲 5 min，然后置于渦旋混勻器上快速混合5 min，待用。檢測前將玻璃瓶上下顛倒混勻。

1．3．4 試劑盒加標(biāo)回收率試驗(yàn) 精確配制4．0 mg/mL的土霉素和鏈霉素溶液，取一定體積標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加至陰性樣品，使樣品的藥物含量分別為40、20、2 ng/g，每個(gè)濃度的樣品作兩次平行提取后分別進(jìn)行檢測，計(jì)算回收率。

1．3．5 試劑盒精密度試驗(yàn) 在空白樣品中加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試劑盒提供的方法樣品預(yù)處理后進(jìn)行檢測。同一天內(nèi)每個(gè)濃度重復(fù)5個(gè)樣，取平均值，計(jì)算日內(nèi)變異系數(shù)。

1．3．6 樣品的檢測 檢測前，首先將所有的試劑必須恢復(fù)到室溫23～27℃，任何不用的試劑須立即放入2～8℃保存。將采集的樣品按照步驟1．3．3方法相應(yīng)的進(jìn)行前處理。全部處理完后，按照試劑盒方法說明進(jìn)行檢測，分析土霉素、鏈霉素兩種藥物的休藥期。

2 結(jié)果與分析

2．1 樣品的采集 按照步驟1．3．1．2的方法對蜂群給藥，在第3次給藥后次天進(jìn)行采樣，每個(gè)蜂群采集到16個(gè)樣品，4個(gè)蜂箱共采集了64個(gè)樣品。采樣期間，天氣適宜時(shí)群蜂以正常方式飼喂，遇有陰雨天時(shí)以糖水飼喂。樣品編號以藥物+箱號+采樣日期表示，如:ST/OT 01 110416(ST是Streptomycin鏈霉素縮寫，OT是Oxytetracycline土霉素縮寫)，即為2011年4月16日采集的鏈霉素/土霉素1號蜂箱樣品。

2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按照1．3．2中的操作，將試劑盒藥物標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，分別得到鏈霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(0．5、1．5、4．5、13．5、40．5 ng/mL)和土霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(1．5、4．5、13．5、40．5、121．5 ng/mL)系列，進(jìn)行ELISA測定，所測的OD450nm隨著藥物標(biāo)準(zhǔn)物濃度的減小不斷增大，在檢測范圍內(nèi)相對吸光值(B/B0)與藥物濃度的對數(shù)值呈線性關(guān)系，進(jìn)行回歸分析，兩個(gè)藥物酶免疫試劑盒的線性關(guān)系良好。結(jié)果見圖1、圖2。

2．3 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取4份1．0 g陰性蜂蜜樣品(每種藥物各2份樣品)，分別添加40、20、2 ng鏈霉素和土霉素，樣品按照步驟1．3．3進(jìn)行前處理，檢測結(jié)果見表1。經(jīng)檢測，鏈霉素、土霉素平均加標(biāo)回收率分別是92．7%、85．6%，與試劑盒說明書一致。

圖1 ELISA方法檢測鏈霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 ELISA方法檢測土霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表1 鏈霉素和土霉素加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2．4 精密度試驗(yàn) 量取適量的鏈霉素、土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別添加到1．0 g陰性蜂蜜樣品中，使其終濃度分別是40、10、2 ng/mL，每個(gè)濃度重復(fù)檢測5次，計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表2。由表2可知鏈霉素、土霉素試劑盒的變異系數(shù)分別是 4．95%、6．39%，重復(fù)性好。

表2 鏈霉素和土霉素ELISA試劑盒變異系數(shù)試驗(yàn)

2．5 樣品的檢測 按照1．3．5方法對采集的64個(gè)樣品進(jìn)行藥物濃度的測定，結(jié)果見表3。表中的采樣時(shí)間是指給藥后的天數(shù)，如編號ST/OT 01/02 110428的樣品是指在給藥后第13天采集的樣品。

表3 樣品中藥物濃度的檢測結(jié)果

3 討論

土霉素是四環(huán)素族藥物，是一種廣譜抗生素，蜂農(nóng)常用它防治蜜蜂幼蟲感染的腐臭病，因此可能會(huì)導(dǎo)致蜂產(chǎn)品中四環(huán)素族抗生素殘留。由于四環(huán)素族抗生素會(huì)在人體內(nèi)富集，從而危害身體健康。鏈霉素是一種氨基糖苷類抗生素，主要毒性反應(yīng)為對第八對腦神經(jīng)的損害，引起耳鳴，頭昏，眩暈等，若使用量較大可導(dǎo)致聽力減退，重聽，甚至有耳聾的可能。

日本是我國蜂蜜出口的主要國家，日本對我國蜂蜜等產(chǎn)品的質(zhì)量要求越來越嚴(yán)格，尤其是2005年11月29日，日本厚生省在日本政府網(wǎng)站上發(fā)布了對日本進(jìn)口所有食品制訂的新控制標(biāo)準(zhǔn)，也就是在2006年6月1日起正式實(shí)施的表格，即日本“肯定列表制度”［13］。我國有關(guān)部門也非常重視獸藥殘留，2003年我國農(nóng)業(yè)部和國家質(zhì)檢總局為解決蜂產(chǎn)品中獸藥及違禁藥物殘留問題聯(lián)合組織開展了蜂產(chǎn)品獸藥殘留專項(xiàng)整治工作。為加強(qiáng)獸藥殘留監(jiān)控工作，保證蜂產(chǎn)品出口安全，于2007年7月9日第二十次修訂了出口食品安全衛(wèi)生檢測監(jiān)控項(xiàng)目，規(guī)定了蜂產(chǎn)品中一些藥物的最高殘留限量［14］。

根據(jù)日本肯定列表規(guī)定，出口日本蜂蜜中的四環(huán)素族抗生素殘留總量小于300μg/kg。根據(jù)國質(zhì)檢食函［2006］308號文，出口日本蜂蜜中鏈霉素殘留限量不得高于 10 μg/kg［13－14］。而歐盟法規(guī)(EEC)NO．2377/90及修訂指令要求，蜂蜜中土霉素檢測限量是10μg/kg。由表2可知，鏈霉素在給藥33 d后其蜂蜜中的殘留量為5．67μg/kg，土霉素在用藥后43 d殘留量為7．77μg/kg，已經(jīng)符合歐盟、日本及美國等進(jìn)口方最嚴(yán)要求(低于10μg/kg)。因此，蜂農(nóng)在采蜜期前45 d內(nèi)切忌使用抗生素類藥物。同時(shí)，在使用相同劑量情況下，蜂蜜中的鏈霉素殘留量要明顯低于土霉素，其在蜜蜂體內(nèi)的消除速度也比土霉素要快。此外，為避免產(chǎn)生耐藥性，建議對四環(huán)素族類和氨基糖苷類族內(nèi)抗生素交替使用。

目前國內(nèi)企業(yè)的出口蜂蜜質(zhì)量控制項(xiàng)目中關(guān)鍵的問題是質(zhì)劣和抗生素的超限問題，而抗生素的超限又是表現(xiàn)得最多的問題［15］。因此，加強(qiáng)源頭管理，提高蜂蜜質(zhì)量，研發(fā)先進(jìn)檢測技術(shù)，對我國蜂蜜產(chǎn)品出口而言是一件重要而且有意義的事情［16］。

［1］ 李春杰，姚 宇．中國蜂產(chǎn)品出口國際競爭力比較分析［J］．云南財(cái)經(jīng)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，22(2):21－23．

［2］ 中國養(yǎng)蜂學(xué)會(huì)．歐盟禁我蜂蜜已波及英國、日本、美國和加拿大等國家［J］．中國養(yǎng)蜂，2002，53(3):31．

［3］ 劉進(jìn)祖，張永貴．淺析中國蜂產(chǎn)品出口遭“零標(biāo)準(zhǔn)”氯霉素封殺及其應(yīng)對措施［J］．中國養(yǎng)蜂，2003，54(3):39－40．

［4］ 陳振起．日本對進(jìn)口蜂蜜新的列表制度對我國養(yǎng)蜂業(yè)的影響［J］．蜜蜂雜志，2006，(4):23－24．

［5］ Kennedy D G，Andrew C，Robert JM．Regulatory problems caused by contamination，a frequently over looked cause of veterinary drug residues［J］．Journal Chromatography A，2000，(882):37－52．

［6］ Bell T A．Antimicrobial susceptibility data and new animal drug approval in the United States:a historical overview［J］．Agriculture，2001，196:245－251．

［7］ 趙樹榮，陳廷珠，李樹軍．控制藥物殘留，促進(jìn)蜂業(yè)發(fā)展［J］．中國蜂業(yè)，2006，(5):39－41．

［8］ 陶柏成，胡智明．出口蜂戶品源頭管理模式探討［J］．中國蜂業(yè)，2006，11:11－12．

［9］ 唐林林．蜂群用藥對蜂蜜中藥物殘留影響的研究［D］．福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008．

［10］任 琴．蜂王漿中藥物殘留來源確定及在蜂群中消除規(guī)律研究［D］．福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008．

［11］龐國芳，張進(jìn)杰，曹彥忠，等．GB/T 18932．23－2003蜂蜜中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測定方法液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［M］．北京，中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003．

［12］李 熠，韓勝明，黃京平．氟氯苯氰菊酯條蜂場休藥期規(guī)定的驗(yàn)證研究［J］．中國蜂業(yè)，2007，58(4):7－9．

［13］中國技術(shù)性貿(mào)易措施網(wǎng)中關(guān)于“日本肯定列表”的相關(guān)中文網(wǎng)站［DB/OL］．http://www．tbt－ sps．gov．cn/jpmrl/Pages/default．a(chǎn)spx．

［14］進(jìn)出口食品安全衛(wèi)生檢測監(jiān)控項(xiàng)目一覽表(2007年7月9日第二十次修訂)［DB/OL］．http://www．ziq．gov．cn/portal/webfiles/web/file/11839652429858819．doc．

［15］馮 峰．蜂蜜中抗生素殘留超標(biāo)的原因剖析及其控制對策［J］．蜜蜂雜志，2002，10:21－22．

［16］張啟明，李位三．防止蜜蜂“藥殘”超標(biāo)的綜合配套措施［J］．蜜蜂雜志，2005，11:33－34．