牛愛麗，廖 青，張 碩，陳玉霜，瞿樹林

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013）

姜黃素 (curcumin)是從姜黃中提取到的一種植物多酚，根據(jù)美國VITY維他命雜志報道：姜黃素對抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗動脈粥樣硬化、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)和抗腎纖維化作用[1]、抗衰老、消除自由基等有很好的幫助。FDA證實其安全無毒，對人類的的安全口服劑量高達(dá)8000 mg/天，因此也倍受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[2]。急性、大強(qiáng)度運(yùn)動及過度訓(xùn)練將引起腎臟缺血再灌注，誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡增加，目前有關(guān)姜黃素對運(yùn)動過程中腎臟損傷的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制報道尚少，故我們通過建立動物運(yùn)動模型探尋姜黃素對運(yùn)動腎損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)理，為其作為運(yùn)動營養(yǎng)補(bǔ)劑和機(jī)體腎臟的保護(hù)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠32只，體重200～280g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公提供(SCXK(湘)2009-0004)。同時購入基礎(chǔ)飼料，自由飲食，飼養(yǎng)溫度18～25℃，濕度50% 左右光線充足，保持通風(fēng)。

1.2 藥物及試劑

姜黃素購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號:110107，純度>95%；氯沙坦(losartan，商品名:科素亞)，片劑，杭州默沙東制藥有限公司產(chǎn)品；腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA檢測試劑盒購自美國R&D生物公司；尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器設(shè)備

721分光光度計 (上海精密儀器有限公司)；手動勻漿器(湘儀天平廠)；高速冷凍離心機(jī)(sigma公司)；HHS-恒溫水浴箱；大鼠訓(xùn)練跑臺(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1.4 實驗分組及模型制備

32只健康雄性SD大鼠，體重200～250g，按體重隨機(jī)分為4組，每組8只，各組間體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義。分別為安靜組(C組)，運(yùn)動組(E組)，氯沙坦+運(yùn)動組(LE組)，姜黃素+運(yùn)動組(CMN組)。每天上午九點(diǎn)，LE組每天灌服氯沙坦20 mg/kg；CMNE組每天灌服姜黃素200mg/kg，C組和E組每天灌服等量生理鹽水一次。C組不作任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)；E組，LE組，CMN組適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，采用 Bedford研究的訓(xùn)練方式進(jìn)行跑臺訓(xùn)練，每周訓(xùn)練6天，每天訓(xùn)練1次，星期天休息，每天下午3點(diǎn)進(jìn)行訓(xùn)練，共訓(xùn)練5周，訓(xùn)練安排進(jìn)行跑臺運(yùn)動，運(yùn)動方式及時間見表1(參照Bedford根據(jù)最大攝氧量所對應(yīng)的強(qiáng)度的研究結(jié)果來選擇運(yùn)動強(qiáng)度)，實驗周期為五周。

表1 大鼠跑臺訓(xùn)練方案

1.5 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測

末次訓(xùn)練結(jié)束后，麻醉后股動脈取血5 mL離心，取上清液，2 mL血肝素抗凝，用于測定BUN、Cr、TNF-α，IL-1β，IL-18的含量。 然后脫頸椎處死大鼠，取腎臟組織置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污后，吸水紙吸干水分，稱重計算腎系數(shù):腎重/體重。

組織勻漿的制備:稱取適量組織(0.2～1g)按W(g)組織塊重量/V(mL)勻漿介質(zhì)為1/9的比例加取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(0.8%的NaCl溶液)于燒杯中，用眼科小剪刀盡快剪碎組織塊(以上操作均在冰水浴中進(jìn)行)。手工制備勻漿后，3000 r/min低溫離心15 min，分離提取上清液4℃冰箱冷藏，用于測定TNF-α，IL-1β 和 IL-18的含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)表示，采用SPSS 18.00軟件對各組間差異進(jìn)行方差分析和t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎系數(shù)與腎功能變化

運(yùn)動組腎系數(shù)、BUN、Cr水平均高于安靜組(P<0.01)，說明腎損傷模型成立。姜黃素干預(yù)后，BUN、Cr含量較運(yùn)動組明顯下降，有明顯差異 (P<0.01)，腎系數(shù)較運(yùn)動組明顯降低，P<0.05，見表2。

2.2 血清及腎組織中TNF-α含量的變化

運(yùn)動組腎組織及血清中TNF-α均較安靜對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與運(yùn)動組相比，姜黃素處理組血清中TNF-α含量明顯下降(P<0.05)，腎組織中有顯著性差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與陽性藥物對照組相比無明顯差異。結(jié)果見表3。

表2 各組大鼠BUN、Cr、腎系數(shù)比較(mean±SD)

表3 各組大鼠血清TNF-α含量的比較(mean±SD)

2.3 血清及腎組織中IL-1β含量的變化

運(yùn)動組大鼠腎組織及血清中IL-1β均較安靜對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，姜黃素處理組腎組織及血清IL-1β含量較運(yùn)動組明顯下降 (P<0.05)，與陽性藥物對照組相比無明顯差異。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠血清IL-1β口含量的比較(mean±SD)

2.4 血清及腎組織IL-18含量的變化

由表5可見，運(yùn)動組大鼠腎組織及血清中IL-18的含量明顯升高，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，姜黃素處理后腎組織及血清中IL-18含量較運(yùn)動組明顯下降(P<0.05)，與陽性藥物對照組相比無明顯差異。

表5 各組大鼠血清IL-18含量的比較(mean±SD)

3 討論

長時間大強(qiáng)度運(yùn)動使體內(nèi)自由基增多，自由基通過攻擊免疫細(xì)胞膜等途徑形成免疫損傷，造成免疫機(jī)能低下[3]。運(yùn)動造成的腎損傷腎臟與運(yùn)動過程中腎臟的缺血再灌注有密切關(guān)系，自1980年Guarnieri首次提出缺血再灌注損傷以來，人們普遍開始采用此理論來解釋運(yùn)動中腎功能異?，F(xiàn)象。腎臟是一個對缺血缺氧非常敏感的器官，造成運(yùn)動中腎功能異?，F(xiàn)象的更重要因素是運(yùn)動停止后，腎供血恢復(fù)形成的運(yùn)動性腎缺血的"再灌注"。腎臟缺血一段時間后，再灌注時氧分子重新進(jìn)入組織內(nèi)，結(jié)果反而缺血損傷進(jìn)一步加劇[4]。

細(xì)胞因子是一些具有高度生物活性的可溶性蛋白或糖蛋白。隨著對細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)認(rèn)識的迅速提高，有關(guān)運(yùn)動腎損傷中細(xì)胞因子的作用日益受到關(guān)注。運(yùn)動損傷可以引發(fā)炎癥反應(yīng)，使許多細(xì)胞因子表達(dá)。炎癥反應(yīng)中研究最多的因子是白細(xì)胞介素-1(IL-1)，主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，腫瘤壞死因子是由嗜中性粒細(xì)胞、活性淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的[5]。研究表明，TNF-α通過激活巨噬細(xì)胞釋放 IL-1β，IL-6，IL-18，前列腺素E2(PGE2)以及TNF-α等，說明TNF-α能以自分泌的形式激活單核巨噬細(xì)胞，與其他細(xì)胞因子之間既可相互誘生，又可共同誘生，參加炎癥損傷的過程。大量研究顯示，TNF-α在心臟、肺臟、肝臟等多種臟器的缺血再灌注過程中作為始發(fā)因子，加重臟器損傷[6]。

補(bǔ)充姜黃素能增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，清除體內(nèi)增多的自由基，從而使機(jī)體的免疫功能得到改善[7]。藥理研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有免疫調(diào)節(jié)的作用，它能夠調(diào)整T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹狀突細(xì)胞的活性；還能夠調(diào)整多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及介導(dǎo)作用，包括腫瘤壞死因子、白介素-1、白介素-2、白介素-6等[8]，且姜黃素價格低廉，安全毒副作用小，目前已嘗試將姜黃素用于阿爾茨海默氏病、哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等與免疫異常相關(guān)的疾病。隨著在細(xì)胞因子水平及分子水平對姜黃素免疫調(diào)節(jié)作用的進(jìn)一步闡明，姜黃素對免疫系統(tǒng)疾病的治療前景將十分光明[9]。

本研究利用大鼠腎臟大強(qiáng)度運(yùn)動損傷模型，用姜黃素干預(yù)，觀測腎組織和血液中的TNF-α、IL-1β和IL-18含量的變化。結(jié)果顯示，運(yùn)動組大鼠腎組織中細(xì)胞因子含量均顯著較對照組顯著升高，姜黃素干預(yù)后，細(xì)胞因子水平明顯下調(diào);本研究結(jié)果表明姜黃素通過抑制TNF-α、IL-1β和IL-18的生成均參與腎臟損傷的保護(hù)作用。

運(yùn)動引起的腎損傷是一個多因素綜合作用的結(jié)果，而機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，少數(shù)細(xì)胞因子的變化并不能完全解釋其損傷機(jī)制[10]。但本研究結(jié)果無疑證實TNF-α、IL-1β和IL-18含量的動態(tài)變化與運(yùn)動腎損傷密切相關(guān)。姜黃素具有較強(qiáng)的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

姜黃素能明顯拮抗長時間大強(qiáng)度運(yùn)動引起的免疫抑制，對運(yùn)動引起的腎損傷具有保護(hù)作用。在長時間大強(qiáng)度訓(xùn)練期間，可以通過在運(yùn)動員的膳食結(jié)構(gòu)中輔加入適量姜黃素，以增強(qiáng)運(yùn)動員在訓(xùn)練期間的免疫功能，提高運(yùn)動成績。

[1]Shen SQ,Zhang Y,Xiang JJ,Xiong CL.Protective effect of curcumin against liver warm ischemia/reperfusion injury in rat model is associated with regulation of heat shock protein and antioxidant enzymes[J].World J Gastroenterol,2007,13(13):1953-1961.

[2]Cheng AL,Hsu CH,Lin JK,Hsu MM,Ho YF,Shen TS,et al.Phase I clinical trial of curcumin,a chemopreventive agent,in patients with high-risk or pre-malignant lesions[J].Anticancer Res,2001,21(4B):2895-2900.

[3]李志清,陳佩杰.運(yùn)動誘導(dǎo)的細(xì)胞因子反應(yīng)及其影響與作用[J].中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志,2002,21(5):484-489.

[4]林仲華.缺血再灌注損傷與運(yùn)動性腎功能異常[J].武漢體育學(xué)院學(xué)報,1992,(4):50-53.

[5]陳秀英.一次急性運(yùn)動對大鼠血漿白細(xì)胞介素的影響[J].北京體育大學(xué)學(xué)報,2000,23(3):347-248.

[6]Suzuki K,Yamada M,Kurakake S,et al.Ciroulating cytokines and hormones with immunosuppressive but neutrophil priming potentials rise after endurance exercise in humans[J].Eur J Appl Physiol,2000,81(4):281-287.

[7]唐傳核,彭志英.姜黃素類物質(zhì)的生理功能以及其抗氧化機(jī)制[J].中國食品添加劑,2000,4:40.

[8]Kim GY,Kim KH,Lee SH,et al.Curcumin inhibits immunostimulatory function of dendritic cells:MAPKs and translocation of NF-kappa B as potential targets[J].J Immunol,2005,174(12):8116-8124.

[9]寧勇,劉曉城.姜黃素對糖尿病大鼠早期腎纖維化的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2004,32(2):77-80.

[10]Ag garwal BB,H arikumar KB.Potential therapeutic effects of curcumin,the anti-inflammatory agent,against neurodegenerative,cardio vascular,pulmonary,metabolic,auto immune and neoplastic diseases[J].Int J Biochem Cell Biol,2009,41(1):40-59.