肖 遐 ，陽國平

（1.中南大學湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙 410013;2.湖南師范大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410013）

三七止血膠囊國家最新批準上市的新藥，其處方來源于《金匱要略》、《傷寒論》，由三七和地錦草兩味藥材組成。本品能止出血、散瘀血、消腫止痛三大功效[1]。維持凝血與抗纖溶動態(tài)平衡，有利于止血而不留瘀[2]；抗菌消炎、消腫定痛，有助于傷口早日愈合。因此本品能顯著減少出血，減輕疼痛，用于消化道出血、血尿、便血、吐血，血痢，月經(jīng)不調(diào)，人流及產(chǎn)后流血不止，功能性子宮出血，痛經(jīng)等。血崩，產(chǎn)后血流不止，月經(jīng)過多及外傷出血。是治療各種出血和傷科的首選藥[3,4]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-10ATvp高效液相色譜儀；HW2-000色譜工作站。 BO211D電子分析天平(西德Sartorious)；精密度試紙。

1.2 試藥

乙腈均為色譜試劑，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。三七止血膠囊：湖南德康制藥股份有限公司；三七止血膠囊對照品：三七皂苷R1批號110745-200915,人參皂苷Rg1批號110703-200924,人參皂苷Rb1批號110704-200920(均由中國藥品生物制品檢定所提供)。

2 含量測定

三七總皂苷是三七止血膠囊中發(fā)揮藥效的主要化學物質(zhì)，其含量的多少是決定藥效的關鍵因素，目前三七止血膠囊并沒有對應的質(zhì)量標準，而是借用《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑 第十一冊中收載的三七止血片的質(zhì)量標準[5]。但從藥代動力學的研究發(fā)現(xiàn)三七止血膠囊的吸收和藥效作用優(yōu)于三七止血片[6]，因此沒有專門的質(zhì)量標準這一問題日益嚴重。需要通過一系列方法學研究得到最準確的三七止血膠囊中的三七總皂苷的含量測定的方法，并且需嚴格按照《中國藥典》2008年版一部附錄ⅠL的膠囊劑項下有關的各項規(guī)定對樣品質(zhì)量進行檢測，以評斷其是否合格[7]。

2.1 色譜條件

色譜柱：C18(Alltima 250×4.6mm，5μL);流動相：以流動相A：乙腈，流動相B：水，采用梯度洗脫方式，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫：

表1 梯度洗脫流動相成分表

2.2 供試品溶液的制備

取裝量差異項下的內(nèi)容物約1g，精密稱定，置于索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流6 h，取甲醇液置水浴上蒸干。殘渣加水30mL使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取5次（25 mL、20 mL、20 mL、10 mL、10 mL）,合并提取液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次 25 mL，棄去水洗滌液，正丁醇液置水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 陰性溶液的制備

按處方比例稱取除三七以外的其余藥味，按制備工藝制成缺三七的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成缺三七的陰性溶液。

2.4 對照品溶液的制備

分別精密稱取三七皂苷R1﹑人參皂苷Rg1﹑人參皂苷Rb1對照品適量，加甲醇制成每1mL中含三七皂苷R10.05mg﹑人參皂苷Rg10.2mg﹑人參皂苷Rb10.2mg的混合溶液，即得。

2.5 含量測定法[8]

分別精密吸取對照品溶液、陰性溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

在上述選定的色譜條件下，供試品色譜中三七皂苷R1﹑人參皂苷Rg1﹑人參皂苷Rb1的峰能與其它組分色譜峰達基線分離，且與其它相鄰色譜峰分離度大于1.5；按三七皂苷R1峰計算，理論板數(shù)在4000以上；陰性溶液色譜中在與人參皂苷Rb1﹑人參皂苷Rg1﹑三七皂苷R1色譜峰相應位置上無色譜峰，說明陰性無干擾，對照品、供試品與陰性樣品的色譜圖分別見圖 1、2、3。

圖1 三七止血膠囊對照品圖譜

圖2 三七止血膠囊樣品測定圖譜

圖3 三七止血膠囊陰性樣品圖譜

2.5 .1線性關系的考察

精密吸取濃度為0.0504mg/mL的三七皂苷R1﹑濃度為0.2080mg/mL的人參皂苷Rg1﹑濃度為0.2068mg/mL的人參皂苷Rb1的混合對照品溶液2、6、10、14、18μL 進樣，測定其峰面積[20]，以進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果如下：

圖4 三七皂苷R1對照品標準曲線圖

結(jié)果表明：三七皂苷R1的回歸方程為：y=180232x+3528.5,R2=0.9999，三七皂苷R1在0.1008～0.9072（μg）的進樣范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關系。數(shù)據(jù)見表2，標準曲線圖見圖4。

結(jié)果表明：人參皂苷Rg1的回歸方程為:y=196947x+12308;R2=0.9999，人參皂苷Rg1在0.4160～3.7440（μg）的進樣范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關系。數(shù)據(jù)見表3，標準曲線圖見圖5。

表2 三七皂苷R1線性關系考察結(jié)果表

表3 人參皂苷Rg1線性關系考察結(jié)果表

表4 人參皂苷Rb1線性關系考察結(jié)果表

結(jié)果表明：人參皂苷Rb1的回歸方程為:y=154206x+12641 R2=0.9999，人參皂苷Rb1在0.4136～3.7224（μg）的進樣范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關系。數(shù)據(jù)見表4，標準曲線圖見圖6。

圖5 人參皂苷Rg1對照品標準曲線圖

圖6 人參皂苷Rb1對照品標準曲線圖

2.5.2 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液(20090501)10μL，重復進樣5次，測定其峰面積積分值，其結(jié)果見表5。

表5 精密度試驗結(jié)果表

表6 穩(wěn)定性試驗結(jié)果表

表7 重現(xiàn)性試驗結(jié)果表

2.5.3 穩(wěn)定性試驗

分別精密吸取供試品溶液(20090501)10μL，于0、3、6、9、12 h 進樣，測定其峰面積積分值，結(jié)果見表6。

2.5.4 重現(xiàn)性試驗

取同一批號樣品(20090501)按上述含量測定方法，測定5次，結(jié)果表明，本法重現(xiàn)性好，見表7。

2.5.5 回收率試驗

取已知含量三七皂苷R1為1.25mg/g、人參皂苷Rg1為6.76mg/g和人參皂苷Rb1為4.16mg/g（20090501批）樣品的內(nèi)容物，精密稱定，研細，取約0.5g，精密稱定，置索氏提取器中，分別精密加入三七皂苷R1的濃度為0.1020mg/mL﹑人參皂苷Rg1的濃度為0.4072mg/mL﹑人參皂苷Rb1的濃度為0.3980mg/mL的混合對照品溶液5mL，加甲醇適量，加熱回流6 h，取甲醇液置水浴上蒸干。殘渣加水30mL使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取 5 次（25mL、20mL、20mL、10mL、10mL）,合并提取液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次25mL，棄去水洗滌液，正丁醇液置水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；按含量測定項下的方法測定，計算回收率，結(jié)果見下表。

2.5.6 藥材的含量測定

參照《中國藥典》2008年版一部三七項下的含量測定方法，對三批藥材進行了三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1三者總量進行測定，結(jié)果見表11。

為保證藥品的質(zhì)量，規(guī)定三七原藥材中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1三者總量不得低于5.0%。

2.5.7 樣品的測定與結(jié)果

按上述擬定的含量測定方法測定供試品十批，結(jié)果見表 2.12、2.13。

表8 三七皂苷R1的回收率測定結(jié)果

表9 人參皂苷Rg1的回收率測定結(jié)果

表10 人參皂苷Rb1的回收率測定結(jié)果

表11 藥材含量測定結(jié)果

表13 樣品含量測定結(jié)果表

結(jié)果表明：十批樣品含量測定結(jié)果的平均值為3.04mg/粒。按平均含量的70%折算，暫定本品限度為：本品每粒含三七以三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1的總量計，不得少于2.0mg。

3 討論

三七止血膠囊中三七為君藥,主含總皂苷,約占4%，亦含黃酮類成分。因地錦草和三七中均含有黃酮成分,含量測定如選擇黃酮類成份為指標,專屬性不強,所以我們選擇以三七中的三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1作為控制該制劑含量的檢測指標,經(jīng)方法學考察,本方法準確可行。

三七止血膠囊的質(zhì)量標準含量測定項可測定三七總皂苷的含量，采用高效液相色譜法測定。色譜柱：C18（Alltima 250×4.6mm，5μL）流動相：以流動相A：乙腈，流動相B：水，采用梯度洗脫方式測定，檢測波長：203nm；流速：1.0mL/min。理論塔板數(shù)按三七皂苷R1峰計算應不低于4000。此方法簡便，準確，無陰性干擾。適合收入三七止血膠囊質(zhì)量標準。

[1]張繼,趙朝偉,趙睿.三七的藥理作用研究進展[J].中國藥業(yè)，2003,12(11):76.

[2]王平.三七對血液系統(tǒng)作用的研究進展[J].中國野生植物資源,2000,19(1):10.

[3]蘇云明,李占偉,宋春燕,等.三七傷藥片抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].中醫(yī)藥學報,1996,(3):52-52.

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[5]中華人民共和國衛(wèi)生部.藥品標準中藥成方制劑 (第11冊)[M].1996.91.

[6]李石蓉,劉春祥,黃小蘭.活血止痛膠囊的質(zhì)量標準研究[J].江西中醫(yī)學院學報,2005,(05):

[7]中國藥典.2008年版一部附錄ⅥB[M].北京:化學工業(yè)出版社.

[8]張力彬,韋建榮.田七花精中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1及三七皂苷F的含量測定[J].藥物分析雜志,2001,21(5):3101.