夏璐玲，祿婷婷，尹 蘋，向躍蕓，徐克前

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，長沙，410013）

卵巢早衰(premature ovary failure,POF)是指在40歲以前出現(xiàn)持續(xù)性閉經(jīng)和性器官萎縮,并伴有卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)及雌激素降低的綜合征。POF人群的發(fā)病率為1%-3%。POF危害婦女健康,長期低雌激素增加了骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、神經(jīng)性變疾病的患病風(fēng)險。同時，POF還可能導(dǎo)致婦女喪失生育能力[1]。近年來,POF的發(fā)病率有逐年上升的趨勢。約半數(shù)以上的POF病因不明,稱為特發(fā)性POF[2]。很多資料表明,POF有較強(qiáng)的遺傳傾向，基因變異或多態(tài)性可能是該病發(fā)病的重要原因[3]。

錯配修復(fù)蛋白除了參與DNA的錯配修復(fù)外，還影響生殖細(xì)胞減數(shù)分裂中DNA重組的效率和忠實(shí)性，其缺陷可致哺乳動物不孕。對減數(shù)分裂和錯配修復(fù)蛋白關(guān)系的研究是從MSH4、MSH5的功能研究開始的，目前確定參與減數(shù)分裂的錯配修復(fù)蛋白包括：MSH4、MSH5、MLH1、MLH3 和 PMS2[4]。 有研究報道MSH5基因敲除的雌性小鼠卵母細(xì)胞池完全喪失，出生后8-10周還出現(xiàn)了卵巢的退化,最終導(dǎo)致不孕[5]，這些研究揭示MSH5基因在卵巢功能起著重要的作用,MSH5的突變可能會影響卵巢功能，導(dǎo)致POF的發(fā)生。本文采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RELF）技術(shù)，以探討錯配修復(fù)蛋白MSH5基因C85T多態(tài)性與卵巢早衰的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

卵巢早衰患者組樣本65例，由中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院提供 (2009年5月～2010年9月被診斷為卵巢早衰)。卵巢早衰的診斷標(biāo)準(zhǔn)為:女性在40歲以前，出現(xiàn)連續(xù)六個月以上閉經(jīng),并有兩次或以上血清FSH>40 U/L（兩次檢查間隔1個月以上)。65例患者的染色體核型均為46,XX。通過病史、身體檢查、FSH測定結(jié)果及輔助檢查(甲狀腺功能、血糖、抗核抗體及B超等)，未發(fā)現(xiàn)發(fā)生POF的明確原因。正常對照組樣本66例，來自同時期中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院已生育婦女，婦科內(nèi)分泌激素檢測及陰道B超檢查證實(shí)子宮及雙側(cè)附件均正常。POF患者年齡在 20～39歲之間，平均（30.7±6.1）歲。 正常對照組年齡在20-39歲之間，平均（30.4±6.3）歲。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 主要儀器與試劑

Matercycler PCR擴(kuò)增儀 （德國 eppendorf公司）；PowerPacTM HC型垂直電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；DYY-Ⅲ5穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；引物合成（上海生工公司）；限制性核酸內(nèi)切酶 Dde I（MBI美國）；血液基因組DNA提 取 試 劑 盒 ，2×Taq PCR Master Mix，50bp DNA Ladder，Marker I（北京天根生化科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

所有研究對象均取靜脈血4 mL,用EDTA抗凝。3日之內(nèi)采用血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。

1.3.2 MSH5基因C85T多態(tài)性檢測

1.3.2.1 PCR擴(kuò)增

引物序列：上游引物：5′-ATCCGCAGAGCCTCCAAG-3′；下游引物：5′-CGCCTCAGTCTCCCAAAG T-3′。 PCR 反應(yīng)體系 50 μL， 其中 2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上，下游引物各 0.8 μL（10 μmol/L），基因組 DNA 模板 1.5 μL（250 ng）。 反應(yīng)采用touchdown PCR:94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,68℃退火30 s,72℃延伸30 s,重復(fù)5個循環(huán),接著94℃變性30 s,68℃退火30 s,之后72℃延伸30 s,反應(yīng)每進(jìn)行1個循環(huán),退火溫度下降0.2℃,直到退火溫度降到64℃,再繼續(xù)10個循環(huán),最后72℃5min。此PCR產(chǎn)物的片段為287bp,與已知相對分子量片段的標(biāo)志物（marker）分別在2%瓊脂糖凝膠上電泳，之后觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.2.2 采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism ，PCR-RELF）技術(shù)檢測MSH5基因C85T多態(tài)性

酶切反應(yīng)：總反應(yīng)體系為 30μL，包括PCR產(chǎn)物 10 μL，限制性核酸內(nèi)切酶 Dde I 1μL(10U)，37℃恒溫孵育12 h。取酶切后產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，銀染觀察結(jié)果。

1.3.2.3 序列分析驗(yàn)證:

隨機(jī)抽取30例卵巢早衰患者標(biāo)本和30例正常對照標(biāo)本進(jìn)行測序（(用下游引物進(jìn)行反向測序)。測序由上海生工公司完成，以驗(yàn)證PCR-RELF技術(shù)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，判斷兩組基因型的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用χ2檢驗(yàn),比較兩組基因型頻率和等位基因頻率分布。

2 結(jié)果

2.1 兩組樣本PCR產(chǎn)物的結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果均顯示清晰的287bp條帶，見圖1。

圖1 MSH5 C85T PCR產(chǎn)物電泳圖 (M:MarkerⅠ;1-6:287bp擴(kuò)增片段)

2.2 MSH5基因C85T多態(tài)性分析

將POF組和正常對照組PCR產(chǎn)物經(jīng)Dde I酶切后，發(fā)現(xiàn)兩組MSH5基因C85T位點(diǎn)處均有堿基C向T的突變（C→T），均有三種基因型，即正常純合型（CC 型）含 6bp、17bp、31bp、90bp、142bp 五條片段，雜合突變型（CT 型）含 6bp、17bp、31bp、68bp、74bp、90bp、142bp 七條片段，純和突變型（TT 型）含6bp、17bp、31bp、68bp、74bp、90bp 六條片段，見圖 2。

2.3 序列分析驗(yàn)證

對隨機(jī)抽取的POF和正常對照標(biāo)本測序，結(jié)果與PCR-RELF完全相同(用下游引物進(jìn)行反向測序)。結(jié)果見圖2。

圖2 PCR-RFLP分析MSH5 C85T RFLP結(jié)果

2.4 兩組樣本MSH5基因的C85T SNP各基因型頻率和等位基因頻率分布的比較

兩組樣本的MSH5 C85T基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，說明所選人群具有代表性。POF組樣本CC,CT,TT基因型頻率與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=0.347，P＞0.05）。POF患者組C,T等位基因頻率與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.559,P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1中。

表1 兩組MSH5 C85T基因型分布和等位基因頻率（%）

圖3 POF患者組和正常對照組不同基因型的測序結(jié)果

3 討論

POF是一類高度異質(zhì)性的疾病,很多原因都可能導(dǎo)致POF的發(fā)病，如自身免疫、代謝異常、感染、醫(yī)源性損傷和遺傳等[2]。家族性POF病例的出現(xiàn)支持了該病與遺傳因素的密切關(guān)系[6-7]。某些基因可能與POF的發(fā)生有關(guān)，包括了位于X染色體長臂（Xq）的基因及常染色體上的基因。X染色體上三個區(qū)域(Xq13-22,Xq26-28和 Xp11.2-22.1)的缺失和易位都與POF有關(guān)。許多基因都位于這個三區(qū)域內(nèi)，如 BMP15、FMR1、FMR2。 常染色體上的相關(guān)基因有 LHR、 FSHR、INHA、FOXL2等[8]。 不難看出,POF可能是一種潛在的多基因遺傳病。

人類MSH5基因包括26個外顯子，位于6號染色體P21.3區(qū)域，序列全長25kb，其中開放閱讀框長2501bp，編碼了一個由834個氨基酸殘基組成的蛋白，推測的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為92.2KDa[9-10]。MSH5基因內(nèi)存在許多編碼區(qū)域的SNP，很多都是非同義突變，其中至少有7個非同義SNP被識別。相關(guān)的SNP改變包括P29S,L85F,Y202C,V206F,R351G,L377F和P786S。Yi等人[11]在對MSH5基因多態(tài)性篩查的研究中發(fā)現(xiàn)MSH5 C85T錯義突變可影響減數(shù)分裂。MSH5 C85T可導(dǎo)致MSH5第29號氨基酸由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸 (P29S)，29號氨基酸位于MSH5與MSH4相互作用的分子域上，MSH5 P29S改變可減弱MSH5與MSH4相互作用，從而影響MSH4、MSH5以MSH4-MSH5異源二聚體的形式參與減數(shù)分裂。人類MSH4-MSH5（即hMSH4-hMSH5）異源復(fù)合物被認(rèn)為可能形成一種滑動夾的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以在減數(shù)分裂前期I或在雙鏈斷裂修復(fù)時穩(wěn)定和維護(hù)Holliday連接點(diǎn)。有學(xué)者[12]建立了hMSH4-hMSH5在減數(shù)分裂重組的模型，這提示hMSH4-hMSH5異源二聚體從減數(shù)分裂的雙鏈斷裂修復(fù)到交叉形成的調(diào)控作用。同時，基因敲除的MSH4和/或MSH5小鼠出現(xiàn)了減數(shù)分裂前期I染色體聯(lián)會的破壞，因此導(dǎo)致不孕不育[5,13-14]。因此，MSH5基因可能對減數(shù)分裂I期同源染色體的聯(lián)會、配對和重組都起著重要的作用。

在胚胎形成時期卵巢中有大約700萬個原始卵泡，而大部分在胎兒時期和出生后都相繼丟失，婦女一生中總共有400至500個卵泡發(fā)育成熟并排出。一個女性生育的年限取決于其卵母細(xì)胞的多少和卵母細(xì)胞消耗的速度。POF的發(fā)病機(jī)制可能是:1.原始卵泡的減少；2.正常卵泡閉鎖過程加速；3.原始卵泡的成熟障礙[1]。卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟都是通過減數(shù)分裂來完成的，其在減數(shù)分裂的任何階段出現(xiàn)問題都會導(dǎo)致不孕不育。而MSH5基因在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂中起到了重要作用。通過對MSH5 C85T基因多態(tài)性與卵巢早衰發(fā)病的相關(guān)性的研究，結(jié)果顯示MSH5 C85T基因型及等位基因頻率分布在卵巢早衰患者組和正常對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

卵巢早衰的發(fā)生和發(fā)展是極其復(fù)雜的病理過程，是一種高度異質(zhì)性的疾病。單純的一個基因變異或多態(tài)性并不一定能導(dǎo)致卵巢早衰的發(fā)生，MSH5的基因型頻率和C,T等位基因頻率在不同種族，群體和個體間分布也存在著差異。雖然本文未證實(shí)MSH5基因C85T多態(tài)性與卵巢早衰的遺傳易感性相關(guān)聯(lián)，但并不能說明MSH5基因多態(tài)性與卵巢早衰的發(fā)病絕對無關(guān)，因?yàn)镸SH5基因有數(shù)個多態(tài)性位點(diǎn)，我們只探討了其中一個，其他的多態(tài)性位點(diǎn)是否與卵巢早衰的發(fā)病有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。全面了解和研究其他的多態(tài)性位點(diǎn)與卵巢早衰發(fā)病的關(guān)系，將會為POF患者提供分子水平上的防治提供新的依據(jù)。

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