唐 敏 ，夏 紅 ，何麗華 ，楊小紅 ，謝宛玉

（1.南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽 4210012；3.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013）

紫花牡荊素(5,3'-dihydroxy-3,6,7,4'-tetramethoxyflavone,casticin,CAS)是一種具有廣泛藥理活性的多甲基黃酮類化合物，近年來文獻(xiàn)報(bào)道CAS對多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用[1]，引起了人們的廣泛關(guān)注。在我們的前期實(shí)驗(yàn)研究中，已證實(shí)CAS具有誘導(dǎo)人卵巢癌HO-8910細(xì)胞凋亡作用，且其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是通過caspase-3級(jí)聯(lián)而實(shí)現(xiàn)的[2]。本研究通過檢測CAS處理HO-8910細(xì)胞內(nèi)活性氧生成和細(xì)胞膜電位改變，并行抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預(yù)實(shí)驗(yàn)，探討CAS誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞凋亡作用是否涉及活性氧介導(dǎo)的線粒體膜去極化作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CAS由湖南師范大學(xué)藥物工程實(shí)驗(yàn)室曹建國教授惠贈(zèng)。人卵巢癌HO-8910細(xì)胞株購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。RPMI-1640（Gibco公司）；新生小牛血清 （杭州四季青）；DMSO （Amresco公司）； NAC、H2DCFH-DA 試劑盒、Rh123（Beyotime）和AnnexinⅤ/PI雙染試劑盒購自南京凱基公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長于培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 AnnexinⅤ/PI雙染色FCM分析

參照文獻(xiàn)[3]方法，取同步化處理24 h的HO-8910細(xì)胞，用含不同受試物的10%小牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，使CAS終濃度為2,4 μg/mL；溶媒對照組終濃度為0.2%DMSO；NAC對照組終濃度為 10 mmol/L NAC；NAC（mmol/L）干預(yù)組則取 NAC 10 mmol/L預(yù)孵育1 h后再加入CAS終濃度為2，4 μg/mL共孵育48 h。 收集細(xì)胞，用冰PBS洗2遍，1000r/m,5min離心，棄上清，按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒使用說明書步驟進(jìn)行Annexin V-FITC及碘化丙啶避光染色，半小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Rh123探針FCM分析

[4]方法，Rh123探針用無血清培養(yǎng)液稀釋，使其終濃度為 10 μmol/L，用1.5mL的 EP管分裝備用，收集處理后細(xì)胞，預(yù)冷 PBS洗滌細(xì)胞2次，1000r/m,5min離心，棄上清，將細(xì)胞重懸于稀釋的Rh123溶液中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 （37℃，30min）。取無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，上機(jī)檢測，激發(fā)波長 488nm，發(fā)射波長 525nm。

1.2.4 H2DCFH-DA探針FCM分析

參考文獻(xiàn)[5]方法,取無血清培養(yǎng)基將H2DCFH-DA探針按1:1000稀釋成終濃度為10 μmol/L溶液，分裝于1.5 mL的 EP管中待用。收集處理后各組細(xì)胞，取預(yù)冷后PBS洗滌 2次，1000rpm×5min離心，棄上清，將細(xì)胞懸浮于稀釋的DCFH-DA溶液中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 30 min，取無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞 3次，流式細(xì)胞儀檢，激發(fā)波長 488nm，發(fā)射波長 525nm。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用mean±SD表示，SPSS 13.0軟件行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)比較用One-Way ANOVA分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CAS對卵巢癌HO-8910細(xì)胞凋亡率的影響

Annexin V/PI雙染色FCM分析結(jié)果顯示CAS(2和4 μg/mL)處理HO-8910細(xì)胞48小時(shí)的細(xì)胞凋亡率分別為 ：9.46±0.95%，14.47±1.47%（P＜0.01），而經(jīng)NAC(10 mmol/L)預(yù)處理后細(xì)胞凋亡率下降到 (4.63±0.57%，5.30±0.50%)（P＜0.01）；說明CAS具有誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞凋亡作用，并提示該作用至少部分依賴于細(xì)胞內(nèi)活性氧生成(圖1)。

2.2 CAS對卵巢癌HO-8910細(xì)胞活性氧生成的影響

H2DCFH-DA熒光探針FCM分析結(jié)果表明CAS(2和 4 μg/mL)處理 48小時(shí)的HO-8910細(xì)胞H2DCFH-DA平均熒光強(qiáng)度分別為：36.73±1.52，57.53±2.83；聯(lián)合 NAC(10 mmol/L)預(yù)處理細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度分別為：13.63±1.25，14.63±1.60(P<0.05)。說明CAS誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞活性氧生成，并證實(shí)NAC具有阻斷CAS誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞活性氧生成作用(圖2)。

2.3 CAS對卵巢癌HO-8910細(xì)胞膜電位的影響

Rh123探針標(biāo)記FCM分析細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位結(jié)果表明，CAS(2和 4 μg/mL)處理 48h的 HO-8910細(xì)胞Rh123平均熒光強(qiáng)度分別為 12.73±1.25、18.20±1.49，明顯低于NAC預(yù)處理組平均熒光強(qiáng)度 （56.20±2.73，59.7±1.79），及溶媒對照組（84.67±3.73）（P<0.01 ）。 說明 CAS誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體膜去極化，而抗氧化劑NAC能有效阻止該過程中的線粒體膜去極化作用(圖3)。

圖2 H2DCFH-DA熒光探針FCM檢測HO-8910細(xì)胞活性氧生成

圖3 Rh123探針標(biāo)記FCM檢測HO-8910細(xì)胞線粒體膜電位

3 討論

卵巢癌是婦科腫瘤中致死率最高的腫瘤，近年來呈上升和年輕化趨勢[6]。如何提高卵巢癌的診治水平，改善治愈率，是函待解決的問題。因此，研發(fā)具有選擇性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，而毒副作用小的卵巢癌治療藥物具有重要的臨床意義。

CAS是一種從蔓荊子(Vitex trifolia L)中提取的具有廣泛藥理活性的多甲氧基黃酮類化合物，近年來研究表明CAS對正常細(xì)胞增殖無影響或影響較小，對人白血病、乳腺上皮癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、人結(jié)腸癌、人大腸癌、人肺癌、人纖維肉瘤、前列腺癌、卵巢癌等癌細(xì)胞株的增殖具有抑制活性[7]。在我們的前期研究中，論證了CAS對HO-8910細(xì)胞的增殖抑制作用以及誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，并對CAS對抑制人卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)以及分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行了初步的探討[2]。

眾所周之，細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的部位是線粒體，其產(chǎn)生的速率與線粒體跨膜電位Δψm的相關(guān)。細(xì)胞受到外來應(yīng)激刺激后，在ROS升高的同時(shí)，可檢測到 Δψm的下降、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放、Cyt C的釋放，激活線粒體凋亡途徑[8]。最近，亦有研究提出CAS抗腫瘤機(jī)制可能通過線粒體功能紊亂或是代謝增加使得ROS水平相對升高，細(xì)胞谷胱甘肽水平降低，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激有關(guān)[9]。在本文的研究中，我們再次證實(shí)CAS誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞凋亡，并呈濃度依賴性。值得注意的是氧自由基清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)有效降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，NAC預(yù)孵育減弱CAS誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞凋亡作用。同時(shí)用Rh123探針FCM檢測線粒體膜電位和H2DCFH-DA探針測定細(xì)胞中ROS的生成量，結(jié)果顯示CAS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中存在ROS增高及線粒體膜電位去極化，NAC預(yù)孵育能有效阻止該過程中的存在ROS生成及線粒體膜電位去極化，說明CAS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中同時(shí)存在ROS升高和線粒體膜電位的降低，并且依賴于ROS的生成。與此前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的CAS抗腫瘤機(jī)制可能通過線粒體功能紊亂或是代謝增加使得ROS水平相對升高，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激相符合。

總而言之，本文再次驗(yàn)證了前期實(shí)驗(yàn)中CAS對人卵巢癌HO-8910細(xì)胞凋亡效應(yīng)，CAS可引起HO-8910細(xì)胞內(nèi)活性氧增加和線粒體膜電位下降，可能涉及氧化應(yīng)激觸發(fā)線粒體誘導(dǎo)凋亡途徑激活。說明CAS可能是治療卵巢癌等惡性腫瘤的有效藥物，具有開發(fā)價(jià)值。然而CAS刺激氧化應(yīng)激的作用機(jī)制，還有待于我們進(jìn)一步研究。

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