田 莉，周 蓓，盛習(xí)鋒，楊小紅，曹建國

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013）

紫花牡荊素(5,3′-二羥基-3,6,7,4′-四甲氧基黃酮類化合物，Casticin，CAS)是一種多甲氧基黃酮類化合物。C-3′和C-5羥基以及C-3和C-4′甲氧基是黃酮類化合物具有強(qiáng)效細(xì)胞毒作用所必需的基團(tuán)[1]，紫花牡荊素含有這些活性必需基團(tuán)。有研究報(bào)道紫花牡荊素能抑制包括人宮頸癌HeLa細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞增殖和生長[2-5]。線粒體在調(diào)節(jié)包括藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等各種凋亡過程中具有重要的作用。本文旨在研究CAS是否通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌HeLa細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢市)，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，置于37℃，5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2天傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑

紫花牡荊素(CAS)(成都普瑞法科技開發(fā)公司產(chǎn)品)；細(xì)胞凋亡ELISA檢測試劑盒(羅氏公司出品)；DNA Ladder檢測凋亡試劑盒(北京博大泰克公司產(chǎn)品)；碘化丙啶(PI；Sigma 公司)；溴化乙錠(EB；Sigma公司)；羅丹明-123(Rh123；Molecular Probes公司)；Caspase-3/9活性檢測試劑盒 (Millipore公司)；鼠抗人 cyto C、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、XIAP、β-actin 單克隆抗體和山羊抗鼠IgG抗體 (Santa Ceuz生物科技公司)；辣根過氧化酶藕聯(lián)抗鼠二抗(Cell Signaling技術(shù)公司)。

1.3 凋亡ELISA試劑盒測定組蛋白/DNA碎片

細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔10000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，分組加藥，10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，PBS稀釋細(xì)胞懸液。反復(fù)凍融使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。3000r/min離心20 min，收集上清作為待測樣品。用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，待測樣本孔中先加入待測樣本 10 μL，再加樣本稀釋液 40 μL，空白對照孔不加，37℃水浴30 min。棄去液體，洗板。每孔加入酶標(biāo)工作液50 μL，空白對照孔不加。37℃水浴30 min。棄去液體，洗板。每孔先加入顯色劑A液50μL，再加入顯色劑B液50 μL，手輕輕震蕩混勻 30 s，37℃避光顯色 15 min。加終止液 50 μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，在終止后15 min內(nèi)，用EXL-800型酶標(biāo)儀405nm波長下測量各孔的吸光度值(A值)。

1.4 PI染色FCM分析Sub-G1細(xì)胞百分率

取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，每瓶4×106個(gè)細(xì)胞接種于100 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)基，加入含受試物或?qū)φ账幤泛?0%小牛血清的培養(yǎng)基，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組1瓶，分別作用24 h。收集1×106個(gè)細(xì)胞，1000r/m離心10 min，4℃以上冷PBS洗一次。用4℃的75%乙醇固定24 h后，PBS洗3次后，經(jīng)0.5g/L的RnaseA消化30 min，用終濃度65 mg/L的PI染色，輕輕混勻，冰浴避光放置1h。用EPICS-XL型流式細(xì)胞儀以488 nm為激發(fā)波長，630 nm測定Sub-G1細(xì)胞百分率。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳法

取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，每瓶4×106個(gè)細(xì)胞接種于250 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁，吸除培養(yǎng)基，加入含受試物或?qū)φ账幤泛?0%小牛血清的培養(yǎng)基，作用48 h。收集細(xì)胞，用PBS液洗2遍，按凋亡細(xì)胞DNA ladder檢測試劑盒說明書的步驟分別提取DNA，置于4℃冰箱過夜。將提取的 DNA 樣品 8.5 μL 與 6×Buffer 1.5 μL 混勻后，加到2%瓊脂糖凝膠(含EB)中進(jìn)行電泳，電泳電壓40V，最后在DBT-08凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察并攝影。

1.6 caspase比色活性試劑盒檢測caspase活性

采用Caspase-3/-9活性ELISA測定試劑盒檢測細(xì)胞Caspase-3/-9活性。取未處理與受試物或?qū)φ账幤诽幚?8h的細(xì)胞4×106個(gè)，按Caspase-3/-9活性ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在λ=405nm測定其吸光度A值。通過計(jì)算A(處理組)/A(DMSO對照組)的倍數(shù)來確定受試物或?qū)φ账幤诽幚韺?dǎo)致細(xì)胞caspase-3/-9活化的程度。以Lysis Buffer和Reaction Buffer混合物作為參比 (調(diào)零組)。

1.7 Rh123染色FCM檢測細(xì)胞線粒體膜電位水平

細(xì)胞傳代，培養(yǎng)24 h，貼壁后，吸除培養(yǎng)基，加入含受試物或?qū)φ账幤泛?0%小牛血清的培養(yǎng)基，作用48 h。收集2.0×106個(gè)受試物處理后的HeLa細(xì)胞，PBS清洗三次，重懸于1mL的1μg/mL Rh123中，37℃暗室孵育30 min。PBS洗滌細(xì)胞三次，用EPICS-XL型流式細(xì)胞儀以507 nm為激發(fā)波長，529 nm為發(fā)射波長測定細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

1.8 Western blot分析

細(xì)胞傳代，培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)基，加入含受試物或?qū)φ账幤泛?0%小牛血清的培養(yǎng)基，作用48 h。收集受試物處理后的細(xì)胞4×106，用冰預(yù)冷的PBS洗兩次，盡量吸凈殘留的PBS，加適量蛋白抽提Lysis Buffer到細(xì)胞中，置于1.5 mL EP管中，冰上放置30 min。 12000 r/m，4℃離心30 min，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白，分裝成小管，-80℃保存。BCA法測定蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳。取下凝膠，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡數(shù)分鐘，用蛋白濕轉(zhuǎn)移裝置4℃將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上 (轉(zhuǎn)膜條件80mA、135 min，適用于小分子量蛋白)，取下PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST液封閉2h，加入適當(dāng)濃度一抗(濃度1:1000)，37℃孵育 1h，然后用TBST漂洗膜3次，每次5 min。加入二抗 (濃度1:1000)37℃孵育1h，TBST洗3次，每次15 min。ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。X光片壓片、顯影、定影。薄層掃描儀 (日本產(chǎn)，型號CS-930)掃描，Alphazmager2200軟件測定印跡區(qū)帶的光密度值。以βactin為內(nèi)參照標(biāo)化，計(jì)算目的條帶的相對密度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用mean±SD表示，采用SPSS15.0軟件，進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CAS對宮頸癌HeLa細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平的影響

圖1顯示，1.0、2.0和4.0 μM的CAS處理后的A405明顯大于對照組(P<0.05)，并且A405以濃度依賴性方式升高(P<0.05)。說明CAS能濃度依賴性誘導(dǎo)HeLa組蛋白/DNA碎片水平增加。

2.2 CAS對宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率的影響

FCM分析結(jié)果表明，1.0、2.0和4.0 μM的CAS處理導(dǎo)致HeLa細(xì)胞Sub-G1細(xì)胞百分率增加 (P<0.05)(圖2A)，時(shí)效研究的結(jié)果顯示，CAS以時(shí)間依賴性方式使Sub-G1細(xì)胞百分率升高 (P<0.05)(圖2B)。說明CAS能濃度依賴性和時(shí)間依賴性誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。

圖2 CAS誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率增高(mean±SD,n=3)與溶媒組比較，*P＜0.05。

2.3 CAS對宮頸癌HeLa細(xì)胞DNA斷裂的影響

圖3示：2.0和 4.0 μM的CAS處理細(xì)胞 48 h，出現(xiàn)典型DNA梯形條帶。說明CAS能有效誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞DNA核小體間斷裂。

2.4 CAS對宮頸癌HeLa細(xì)胞caspase-3/-9活性的影響

圖4A 表明，0.5、1.0、2.0和 4.0μM 的 CAS處理

圖3 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖4 CAS降低宮頸癌HeLa細(xì)胞線粒體膜電位(mean±SD,n=3)與溶媒組比較，*P＜0.05。

2.5 CAS對宮頸癌HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Rh123染色FCM檢測細(xì)胞線粒體膜電位的結(jié)果證實(shí)，不同濃度CAS處理后，線粒體熒光強(qiáng)度以濃度依賴方式降低(P<0.05)，4μM CAS組熒光強(qiáng)度是對照組的1/4(圖5)。說明CAS具有降低宮頸癌HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的作用。

2.6 CAS對宮頸癌HeLa細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，細(xì)胞色素C和Bax蛋白隨著CAS濃度升高表達(dá)升高，而Bcl-xL和XIAP的表達(dá)卻依次降低(圖6)，這些結(jié)果提示CAS激活引起宮頸癌HeLa細(xì)胞caspase-3和-9活性增高(P<0.05)，且呈濃度依賴性。說明CAS濃度依賴性活化HeLa細(xì)胞caspase-3和caspase-9。同時(shí)分別給予caspase抑制劑zVAD-fmk和zLEHD-fmk，再用4μM CAS處理HeLa細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖4B)。這表明，CAS誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡依賴于CAS對caspase-3和caspase-9的活化作用。HeLa細(xì)胞線粒體凋亡途徑。有趣的是Bcl-2的表達(dá)并未受到CAS處理的影響。

圖4 CAS激活宮頸癌HeLa細(xì)胞caspase-3和-9(mean±SD,n=3)與溶媒組比較，*P＜0.05；與單用 4.0μMcasticin處理比較，#P＜0.05。

3 討論

CAS是蔓荊子中的一種多甲氧基黃酮類化合物，作為一種中藥抗炎劑廣泛用于民間[1]，據(jù)報(bào)道其能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[1-5]。Csupor-Loffler等證實(shí)CAS能顯著抑制人子宮頸癌HeLa細(xì)胞系的增殖[1]。本研究首次證實(shí)CAS通過線粒體凋亡途徑，劑量依賴性誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡。

圖6 CAS調(diào)節(jié)宮頸癌HeLa細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)釋放出核小體，而核小體由組蛋白和DNA片段組成。我們采用ELISA檢測核小體的釋放，CAS能濃度依賴性誘導(dǎo)HeLa組蛋白/DNA增加(圖1)。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，PI染料通過細(xì)胞膜，使核DNA染色。凋亡細(xì)胞核酸內(nèi)切酶活化，使DNA降解，細(xì)胞DNA分子量減小，因此在G0/G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰(Sub-G1)。Sub-G1細(xì)胞百分率也代表細(xì)胞凋亡百分率。PI染色FCM結(jié)果說明CAS能劑量依賴性和時(shí)間依賴性導(dǎo)致Sub-G1百分率升高(圖2A和B)。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，DNA發(fā)生斷裂，小分子量DNA片段增加，高分子DNA減少，瓊脂糖凝膠電泳后會(huì)形成典型DNA梯形條帶。濃度為2.0和4.0μM的CAS處理細(xì)胞后，出現(xiàn)了典型DNA梯形條帶(圖3)。綜合以上，我們證明了CAS誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡。

線粒體在各種凋亡過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，包括藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。Bcl-2家族成員調(diào)控線粒體死亡途徑，而Bcl-2家族是通過調(diào)節(jié)促凋亡和抗凋亡分子之間的相互作用，來決定細(xì)胞命運(yùn)[7,8]。Bax是Bcl-2家族中的一種促凋亡蛋白，它的上調(diào)表明有線粒體的參與，因Bax在線粒體外膜形成通道以促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放[9,10]。線粒體通透性轉(zhuǎn)變的活化是使得細(xì)胞色素c完全釋放所必需的[11]。我們的結(jié)果表明，CAS并沒有改變Bcl-2的表達(dá)水平，而是下調(diào)Bcl-xL和上調(diào)Bax表達(dá)水平。Bax/Bcl-xL比例的增加是否在CAS誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡方面起著重要作用，還有待闡明。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞色素c從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)，是凋亡體聚集以及隨后的caspase-3/-9的活化所必需的，Apaf-1分子構(gòu)象改變并促使pro-Cas-9與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能水解pro-Cas-3，激活caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在caspase-9/-3活化的同時(shí)，XIAP下調(diào)，使得caspase從抑制形態(tài)釋放出來[9,12]。

我們的研究結(jié)果表明，CAS通過線粒體死亡途徑誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡。我們首次證明了CAS降低ΔΨm、上調(diào)Bax表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放、下調(diào)Bcl-xL和XIAP、活化caspase-9和caspase-3。此外，廣譜性caspase抑制劑zVAD-FMK阻斷CAS細(xì)胞凋亡作用，而caspase-9抑制劑zLEHD-fmk有抑制作用。因此，我們得出這樣的結(jié)論：在人宮頸癌細(xì)胞系，CAS引起線粒體功能障礙，并能觸發(fā)依賴于caspase的細(xì)胞凋亡。

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