邢小偉，張勇，楊慧瓊，戴哲娟，符曉華

（湖南師范大學醫(yī)學院心血管病研究室，湖南 長沙 410006）

7-二氟亞甲基-5,4'-二甲氧基異黃酮(7-difluoromethyl-5,4'-dimethoxygenistein， DFMG),是本課題組以金雀異黃素(GEN)為先導化合物設計合成,并通過建立血管內皮氧化應激損傷模型篩選出的一種較GEN保護血管內皮氧化應激損傷作用更強的活性新化學實體[1](專利號：ZL200710104389.4)。

血管內皮的損害是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動因素[2]。將正常動物血管暴露于ox-LDL的主要活性成分溶血性磷脂酰膽堿 (lysophosphat-idy lcho line,LPC),也能產生與動脈粥樣硬化時相似的血管內皮依賴性舒張功能的損害[3]。但是LPC損傷血管內皮細胞機制未盡明了。細胞角蛋白(cytokeratin，CK)是一個最大的中間絲家族。K18除發(fā)揮機械性支撐細胞的骨架作用外，還具有調節(jié)細胞周期、細胞凋亡的重要作用。K18的磷酸化主要位于33,52位絲氨酸(Ser33,Ser52)殘基上[4],其中Ser33位磷酸化以點特異的方式調節(jié)K18與14-3-3蛋白的結合,進而調節(jié)細胞周期的進展以及細胞凋亡作用[5]。本課題組實驗研究已經證實：DFMG及其先導化合物GEN可以拮抗LPC誘導HUVE-12細胞凋亡，抗體芯片結果顯示，DFMG及其先導化合物GEN可以抑制LPC誘導HUVE-12細胞角蛋白18表達?；谏鲜鲅芯勘尘凹皩嶒灲Y果，我們提出以下科研假設：DFMG及其先導物GEN拮抗LPC誘導HUVE-12細胞凋亡作用與調節(jié)角蛋白18磷酸化表達密切相關。

為探究DFMG對LPC誘導HUVE-12細胞角蛋白18磷酸化的影響,本實驗通過體外培養(yǎng)HUVE-12細胞,建立 LPC誘導 HUVE-12細胞凋亡模型,用流式細胞術、western blotting等方法,對照觀察GEN和DFMG對LPC誘導的HUVE-12細胞角蛋白18磷酸化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗體與細胞系

CK18 一抗、CK18(ser33)一抗、β-actin 單克隆抗體均購自美國santa公司，二抗(Anti-goat)購自美國Jackson公司，人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells HUVE-12),武漢市中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

1.1.2 藥品與試劑

7-二氟甲氧基-5,4-二甲氧基異黃酮由本實驗室參照文獻方法[6]合成,純度 >99%,分子式為C18H14O5F2,分子量為348,性狀為淡黃色晶體粉末;金雀異黃素,美國 Sigma公司生產。二甲基亞砜,美國 Amresco公司生產;溶血性磷脂酰膽堿,美國 Sigma公司生產;胰蛋白酶,美國 Amresco公司生產;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清,均購自美國Hyclone公司，Annexin-V-FLUOS Staining Kit購自美國羅氏(Roche)公司，其余為國產分析純試劑。

1.1.3 主要儀器

高速冷凍離心機,美國 Sigma公司產品;恒溫水浴箱,杭州藍天儀器廠產品;Eppendorf加樣器,德國Eppendorf公司產品;EPICS-XL流式細胞儀,美國Beckerman Counter產品。二氧化碳細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司生產，醫(yī)用凈化工作臺：蘇州凈化設備公司生產，流式細胞儀:美國Beckerman counter EPICS-XL；垂直電泳儀及轉膜系統(tǒng):美國Bio-Rad公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京市六一儀器廠生產，型號DYY-8B；凝膠電泳成像系統(tǒng)：Alpha Innotech公司生產，AiphaimagerTM 2200型號;圖像分析系統(tǒng):中國武漢華海公司生產；各種培養(yǎng)器皿、培養(yǎng)瓶、24 孔培養(yǎng)板：Becton Dickinson，USA.

1.2 方法

1.2.1 LPC誘導HUVE-12細胞凋亡模型的制備以每孔 1×106的細胞數,接種于 6孔培養(yǎng)板內,培養(yǎng)HUVE-12至細胞融合率達80%左右;棄原來培養(yǎng)基,分別加入含10μmol/L的LPC的添加1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，分別孵育6h、12h、24h和48h，每組設3個復孔，收集細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基吹打，制成單細胞懸液并調節(jié)細胞濃度為1×106/mL裝入離心管中，1000r/min,4℃離心5min。棄上清液，冷PBS液1000r/min,4℃離心5min，棄上清液，加入配制好的100μL的Annexin-V-FLUOS標記溶液重懸細胞，15～25°C避光孵育10～15min，然后每管加入0.5毫升孵化緩沖液，隨即上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，流式儀激發(fā)光波長用488nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于600nm的濾器檢測PI。

1.2.2 分組設計設空白對照組、溶媒對照組 (0.01%DMSO)、陽性藥物對照組 (洛伐他汀50μmol/L)、LPC模型對照組、先導化合物不同濃度 (0.3,1.0,3.0μmol/L)對照組、DFMG不同濃度(0.3,1.0,3.0μmol/L)實驗組。

1.2.3 DFMG對LPC誘導HUVE-12凋亡率的影響以每孔 1×106的細胞數,接種于 6孔培養(yǎng)板內,培養(yǎng) HUVE-12至細胞融合率達80%左右;棄原來培養(yǎng)基,分別用不同濃度的 GEN、DFMG及洛伐他汀預孵育1 h后,在各組中分別加入10 μmol/L的LPC,每組設 3個復孔;繼續(xù)孵育 24 h后,分別收集細胞,按上法用Annexin-V-FLUOS標記溶液重懸細胞，15～25°C 避光孵育 10～15 min，然后每管加入0.5mL孵化緩沖液，隨即上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，以上實驗重復3次。

1.2.4 DFMG對 LPC誘導的 HUVE-12細胞角蛋白18磷酸化的影響

按上述處理分組將細胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h后在冰上棄除培養(yǎng)液，用PBS液洗滌細胞兩次，加入1XSDS加樣緩沖液到培養(yǎng)瓶中，向細胞中加入PMSF的細胞裂解液50 μL，在冰上裂解30～60 min，用橡膠刮子刮下細胞移入EP管中，4℃ 12000 r/min離心5 min，吸取上清液轉移入EP管-70℃保存。Bradford法蛋白定量后測定蛋白質的濃度，加入緩沖液。配膠，上樣，電泳，半干轉膜，封閉，分別加入一抗孵育過夜，PBST洗膜，加二抗，搖床搖1 h，PBST洗膜，加發(fā)光液發(fā)光，ImageJ分析軟件采集圖像并分析。

1.2.5 統(tǒng)計學處理

各組實驗數據以均數±標準差表示,數據分析使用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件。 多個樣本均數采用單因素方差分析 (ANOVA),兩兩比較采用 LSD-t檢驗，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LPC誘導HUVE-12細胞凋亡模型的制備

AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色流式細胞術分析結果顯示，HUVE-12細胞凋亡率隨著 LPC處理時間的延長而增加。10 μmol/LLPC處理 6 h后HUVE-12細胞凋亡率稍有增高，由空白對照組的1.61±0.67%上升到3.67±0.49%，但無統(tǒng)計學意義。10 μmol/LLPC孵育HUVE-12細胞12 h凋亡率開始增高，達到11.35±1.59%，與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。10 μmol/LLPC孵育HUVE-12細胞24 h后凋亡率顯著升高到30.98±2.04%，與空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，而10 μmol/LLPC孵育HUVE-12細胞48 h后凋亡率急劇上升，大部分細胞出現凋亡，凋亡率達到78.31±0.79%,與 LPC24h組比有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。(見表1)。

表1 LPC(10umol/L)作用不同時間HUVEC-12細胞凋亡率的比較(mean±SD)

2.2 DFMG對LPC誘導HUVE-12凋亡率的影響

AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色流式細胞術分析結果顯示，LPC10 μmol/L與細胞孵育24 h后，明顯誘導細胞凋亡(30.98±2.04)與空白對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.001)。DFMG和GEN不同濃度組(0.3，1.0，3.0μmol/L) 依次降低 LPC 誘導的細胞凋亡，其中DFMG組的細胞凋亡率分別為28.50±2.06%,25.52±2.59%,13.70±2.00%; 且凋亡率均低于相應濃度GEN作用后的細胞凋亡率(33.42±2.09%,30.57±0.76%,27.29±2.49% (P<0.05)(見圖 1 和圖2)。

2.3 DFMG對LPC誘導的HUVE-12細胞角蛋白18磷酸化的影響

Western印跡檢測結果表明：LPC可以上調ck18(ser33)蛋白表達，對未磷酸化ck18表達無明顯作用，發(fā)現用DFMG、GEN預孵育LPC 10 μmol/L模型后，LPC上調上述蛋白表達的作用均不同程度地減弱，經圖像分析系統(tǒng)分析表明，正常對照組的ck18(ser33)和B-actin產物條帶積分光密度值之比為 0.52，DFMG和 GEN實驗組的 ck18(ser33)和 B-actin產物條帶積分光密度值之比分別為0.33和0.48，而 LPC 30μmol/L 模型組的 ck18(ser33)和 B-actin產物條帶積分光密度值之比為0.69，分別為DFMG和GEN實驗組的2.09倍和1.44倍。進一步證實DFMG及其先導物GEN拮抗LPC誘導HUVE-12細胞凋亡作用與調節(jié)角蛋白18磷酸化表達相關，而且相應濃度的DFMG作用強于GEN（見圖 3）。

圖1 DFMG對LPC誘導HUVE-12細胞凋亡率的影響

圖2 DFMG對LPC誘導HUVE-12細胞凋亡率的影響

圖3 DFMG對LPC誘導的HUVE-12細胞角蛋白18磷酸化的影響

3 討論

關于動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展機制的學說有很多，目前尚無一個機制可以完全解釋AS發(fā)生的原因。除了占主導地位的"損傷-反應假說"之外，隨著近年來對細胞凋亡的關注，已有許多研究證實內皮細胞凋亡在動脈粥樣硬化中起著非常重要的作用[7]。

氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL)是目前研究最多的致動脈粥樣硬化因素。有研究表明,ox-LDL能誘導體外培養(yǎng)的內皮細胞發(fā)生凋亡,其作用具有劑量依賴性和時間依賴性[8],說明ox-LDL誘導內皮細胞損傷可能是其致AS機制之一。進一步研究發(fā)現,ox-LDL的主要成分是LPC，它是在低密度脂蛋白 (LDL)的氧化過程中,經磷脂酶 A2水解LDL中的磷脂酰膽堿 (PC)轉化而成，LPC能完全模擬ox-LDL致動脈粥樣硬化作用[9],但目前關于LPC在AS的發(fā)生過程中對細胞增殖和凋亡影響的作用機制報道尚少。

在本文的研究中，我們通過AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡率。結合本課題組前期實驗結果及預實驗結果，發(fā)現10μmol/L LPC為適宜的造模濃度，LPC處理HUVE-12細胞6 h，細胞損傷作用尚比較小，但隨著LPC作用時間的延長，LPC對細胞的損傷作用越來越大，凋亡率逐漸升高，10μmol/L LPC作用細胞 24 h后凋亡率為30.98±2.04%，當10μmol/L LPC作用細胞48h后細胞大量死亡，一方面原因可能與細胞老化有關，另一方面可能晚期凋亡率及壞死率過高對細胞已造成不可逆的損傷。因此，結合相關文獻[1]我們認為LPC 10μmol/L作用24 h是適宜的造模濃度和作用時間。

長期以來人們認為角蛋白的主要作用是機械性的支撐作用。然而,僅僅從其結構上的功能根本無法解釋角蛋白的組織和細胞特異性表達。磷酸化是角蛋白的主要翻譯后修飾作用,與角蛋白的可溶性、纖維重組和角蛋白與其他胞漿內蛋白結合作用的調節(jié)有關[10]。本文實驗結果證實,LPC能夠誘導HUVE-12細胞凋亡，并且上調ck18(ser33)蛋白表達，對未磷酸化ck18蛋白表達無明顯作用，提示我們CK18的磷酸化很可能作為一種信號參與著細胞的損傷調控和凋亡機制。相關文獻 [5-6]表明，CK18的磷酸化可以調節(jié)細胞周期的進展以及細胞凋亡作用，進一步證實了LPC誘導HUVE-12細胞凋亡與上調ck18(ser33)蛋白表達密切相關。Masters[11]等研究證實14-3-3蛋白具有抑制 Bad和其他細胞凋亡相關蛋白的作用，因而認為14-3-3蛋白可能通過Bcl-2蛋白家族凋亡調控系統(tǒng)抑制細胞凋亡作用，而CK18Ser33位磷酸化可以調節(jié)CK18與14-3-3蛋白的結合,進而調節(jié)細胞周期的進展以及細胞凋亡[5-6]。本文的實驗結果表明，不同濃度DFMG及其先導化合物 GEN,均可拮抗LPC的這種損傷作用，并不同程度的減弱LPC上調上述蛋白的作用,說明DFMG及其先導物GEN能通過下調角蛋白18磷酸化表達發(fā)揮保護LPC誘導HUVE-12細胞凋亡作用，而且相應濃度的DFMG作用強于其先導化合物GEN，其作用機制可能與阻斷磷酸化的CK18通過Bcl-2蛋白家族調節(jié)細胞凋亡途徑有關。但是CK18對于HUVE-12細胞凋亡的調節(jié)作用較復雜,仍需大量實驗證實。本研究為進一步探討DFMG拮抗LPC誘導HUVE-12細胞凋亡產生機制提供了實驗和理論支持。

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