郝大勇，張 展，管一春，王興玲，孫麗君，婁 華

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052

人類輔助生殖技術(shù)在治療不孕不育癥的過程中取得了很大的進(jìn)展，而卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)作為治療男性嚴(yán)重少弱精癥的主要措施，已經(jīng)成為一項(xiàng)重要的輔助生殖技術(shù)。影響ICSI結(jié)局的因素中以卵子質(zhì)量最為重要，第一極體出現(xiàn)是卵子核成熟的標(biāo)志。作者通過對(duì)第一極體形態(tài)評(píng)價(jià)來判斷卵子質(zhì)量，了解不同取精方法對(duì)不同型別的第一極體卵母細(xì)胞經(jīng)ICSI后受精、卵裂情況的影響。

1 材料與方法

1.1 卵子來源 2009年2月至8月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心行ICSI助孕治療的共110周期中，取處于第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)的卵母細(xì)胞1017枚，應(yīng)用倒置顯微鏡(日本尼康TE-300)觀察第一極體形態(tài)，分為4型[1]。Ⅰ型:圓形或橢圓形，形態(tài)完整并且表面光滑。Ⅱ型:圓形或橢圓形，形態(tài)完整，但表面粗糙。Ⅲ型:呈碎裂或多個(gè)。Ⅳ型:巨大型[2]。

1.2 精子來源 手淫取精738個(gè)、附睪穿刺/睪丸活檢(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)/(testicular sperm aspiration，TESA)取精250 個(gè)、冷凍復(fù)蘇精液29個(gè)。

1.3 卵子和精子準(zhǔn)備 所有卵子取出后置于100 g/L人類血清白蛋白(美國SAGE公司)的HTF受精液中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)6%CO2條件下培養(yǎng)3～7 h，采用含80 kU/L的透明質(zhì)酸酶(美國SAGE公司)消化卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，使用FlexipetTM剝卵針吸取吹打卵子數(shù)次，直至卵丘細(xì)胞完全脫落。剝好的卵子置于HTF受精液中培養(yǎng)0.5～1 h后行ICSI。精子準(zhǔn)備:新鮮精液和冷凍精液均采用密度梯度離心法。附睪和睪丸精液采用粉碎后直接離心洗滌，取沉淀做微滴待用。

1.4 ICSI操作 將卵子和精子分別加入到蓋有礦物油(美國SAGE公司)的微滴中，應(yīng)用顯微操作儀(德國 Eppendorf)，使用35度角 ICSI針(K-MPIP-1035，美國 COOK公司)在37℃恒溫下選擇活力好、形態(tài)正常的精子在聚乙烯吡咯炔酮中制動(dòng)并在卵子液滴(美國HEPES公司)內(nèi)行穿刺注射。注射之后的卵子放置在被覆礦物油的約25 μL卵裂液(美國SAGE公司)微滴中，37℃，體積分?jǐn)?shù)6%CO2條件下培養(yǎng)。

1.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.5.1 受精卵評(píng)價(jià)[1]ICSI后16～20 h觀察卵子受精情況，無原核為未受精，雙原核和雙極體為正常受精，一個(gè)或多個(gè)原核為異常受精。

1.5.2 胚胎的評(píng)價(jià)[1]ICSI后68～72 h評(píng)價(jià)胚胎質(zhì)量，并分為4級(jí)。Ⅰ級(jí):細(xì)胞大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)均清晰，無顆粒及多核現(xiàn)象，碎片＜5%(優(yōu)質(zhì)胚胎)。Ⅱ級(jí):細(xì)胞大小略不均勻，形狀略不規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)可有顆粒，碎片6% ～20%(優(yōu)質(zhì)胚胎)。Ⅲ級(jí):細(xì)胞大小明顯不均勻，可有明顯的形狀不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片21% ～50%(可利用胚胎)。Ⅳ級(jí):細(xì)胞大小嚴(yán)重不均，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆粒現(xiàn)象，碎片＞50%(不可利用胚胎)。

1.5.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)[1]正常受精率=(正常受精卵子數(shù)/ICSI卵子數(shù))×100%;卵裂率=(正常受精卵裂胚胎數(shù)/正常受精卵子數(shù))×100%;優(yōu)質(zhì)胚胎率=(優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù))×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。不同取精方式4種類型第一極體卵母細(xì)胞經(jīng)ICSI后正常受精率、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率間的比較采用χ2檢驗(yàn)和精確概率法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 手淫取精I(xiàn)CSI后正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較 見表1。

表1 手淫取精I(xiàn)CSI后正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較 %

2.2 PESA/TESA取精I(xiàn)CSI后正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較 見表2。PESA/TESA取精患者所用卵母細(xì)胞無Ⅳ型第一級(jí)體。

表2 PESA/TESA取精I(xiàn)CSI后正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較 %

2.3 冷凍復(fù)蘇精液ICSI后正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較 見表3。冷凍復(fù)蘇精液患者所用的卵母細(xì)胞無Ⅱ和Ⅳ型第一極體。

表3 冷凍復(fù)蘇精液ICSI后正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較 %

3 討論

有報(bào)道[2-5]稱極體退變可導(dǎo)致紡錘體損害且分散，使染色體丟失，可能與卵母細(xì)胞老化有關(guān)。也有研究[1，6-7]證實(shí)卵母細(xì)胞第一極體形態(tài)與 ICSI胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局有關(guān)，認(rèn)為極體形態(tài)可用來判斷卵母細(xì)胞質(zhì)量。當(dāng)使用不成熟極體卵母細(xì)胞受精或在此階段行ICSI，往往受精率較低，且常停滯在第一卵裂期[6]。卵母細(xì)胞第一極體形態(tài)影響ICSI受精率和胚胎質(zhì)量，而胚胎發(fā)育速度不受其影響[8]。巨大型極體可使受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率下降，但是碎裂型胚胎并不影響ICSI結(jié)局[9]。Ⅰ型第一極體卵母細(xì)胞成熟程度高，妊娠率高[10]。

以往國內(nèi)外的類似報(bào)道并未對(duì)卵子按精液來源的不同進(jìn)行詳細(xì)的分類分析，作者將1017枚人卵母細(xì)胞按精液來源的不同分為3種類型，排除了由于精子質(zhì)量相差較大對(duì)ICSI后結(jié)局的干擾。男性每次手淫排射取出的精子，多數(shù)屬于成熟期精子，并且有完整的結(jié)構(gòu)(精子頭、體、尾)。PESA/TESA取精主要是針對(duì)手淫排射取出的精液內(nèi)沒有精子，而進(jìn)行附睪或睪丸內(nèi)的創(chuàng)傷性取精。主要是由于睪丸生精功能障礙，無法產(chǎn)生大量精子，或是輸精管梗阻造成精液不能排出體外而進(jìn)行PESA/TESA取精。取出的精子均伴有不同程度的畸形、活動(dòng)力低下等異常，精子質(zhì)量較差。冷凍精液是指添加過冷凍保護(hù)劑的精液在一定冷凍降溫程序后，最后放入液氮(－196℃)中超低溫保存。雖然精子經(jīng)過冷凍復(fù)蘇后，仍然可以保持激活卵母細(xì)胞的能力，但冷凍解凍過程和冷凍保護(hù)劑的添加對(duì)精子質(zhì)量有影響。該研究結(jié)果顯示手淫取精組Ⅰ和Ⅱ型第一極體卵母細(xì)胞正常受精率高于Ⅲ、Ⅳ型，這與報(bào)道[9]有異。PESA/TESA取精組中Ⅰ型第一極體卵母細(xì)胞取卵后第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率高于Ⅱ型，但受精率低于Ⅱ型。分析可能是由于PESA/TESA精子質(zhì)量相差較大導(dǎo)致的，而卵子因素并不突出。冷凍復(fù)蘇精液組第一極體與ICSI關(guān)系分析結(jié)果無明顯差異可能與例數(shù)少有關(guān)。

綜上所述，通過排除精子對(duì)ICSI受精的較大影響，正常受精和第一極體形態(tài)有關(guān)。第一極體形態(tài)分型在某種程度上可以判斷卵母細(xì)胞質(zhì)量，并且可以預(yù)測ICSI后的受精情況。

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