劉旭幫，張麗華，李小威，牛少輝

鄭州大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450014

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后室性心律失常是AMI早期嚴重的并發(fā)癥和猝死的主要原因。心肌梗死后心律失常的發(fā)生機制尚不完全清楚，但是AMI后梗死周邊區(qū)存活的心肌離子通道的電重構(gòu)是心律失常發(fā)生的主要機制。研究[1]發(fā)現(xiàn) KCNE基因家族成員中 KCNE1、KCNE2主要在心肌表達，作為β-亞單位與電壓依賴性鉀離子通道α-亞基形成完整的鉀通道復合體并對其進行調(diào)節(jié)，穩(wěn)定細胞膜電生理特性。另有研究[2]表明KCNE基因表達異?？蓪е滦募〖毎娡ǖ拦δ苷系K，誘發(fā)各種惡性心律失常。作者觀察了AMI后梗死周邊區(qū)心肌組織中KCNE1、KCNE2 mRNA和蛋白表達的變化及β受體阻滯劑比索洛爾對上述指標表達的影響，為研究抗心律失常作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔級SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g(鄭州大學實驗動物中心)。富馬酸比索洛爾(5 mg/片，批號 105832，商品名康忻，Merck KGaA 公司);RNAiso Plus、RT-PCR試劑盒(北京全式金生物科技有限公司);兔抗鼠KCNE1一抗(Santa Cruz公司);兔抗鼠KCNE2一抗(Chem Icon公司);辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。小動物呼吸機(HX-300S，成都泰盟科技有限公司);生物信號采集分析系統(tǒng)(ASB240U，遨生電子有限公司)。

1.2 動物模型的制備、分組與處理 SD大鼠用100 g/L水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥位固定，氣管插管并連接小動物呼吸機及生物信號采集系統(tǒng)，標準肢體導聯(lián)Ⅱ動態(tài)監(jiān)測心電圖。于胸骨左緣外四、五肋間心臟搏動最強處縱行切開皮膚，止血鉗依次分離各層組織至肋骨，充分暴露心臟，在左心耳和肺動脈錐間距主動脈根部約2～3 mm處用6.0無創(chuàng)傷縫線穿過冠狀動脈左前降支(left anterior descending of coronary artery，LAD)并結(jié)扎。結(jié)扎后，前壁心肌組織由鮮紅色迅速變?yōu)榘导t色，逐漸變?yōu)樯n白，心電圖監(jiān)測肢體導聯(lián)ST段較前上抬＞0.2 mV為心梗模型制作成功。關閉胸腔后逐層縫合組織。術(shù)后存活的40只大鼠，按照隨機數(shù)字表法分為AMI 24 h組、1周組、4周組和比索洛爾組，每組10只。假手術(shù)組于LAD下穿過縫合線，不結(jié)扎，余操作同AMI各組。假手術(shù)組大鼠共30只，隨機分配到上述3個時間點，每個時間點10只。比索洛爾組給予比索洛爾0.5 mg/(kg·d)灌胃給藥4周，其余各組給予等量生理鹽水。術(shù)后于各時間點以100 g/L水合氯醛麻醉大鼠后迅速開胸取出心臟，用生理鹽水沖洗后速取心梗區(qū)周圍組織均分為2份，液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 KCNE1，KCNE2 mRNA 表達的檢測 采取RT-PCR法。取心肌標本組織約100 mg，加入液氮完全研碎。按試劑盒說明提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。KCNE1上游引物:5’-GGCAGGAAACAGATGAGC-3’， 下 游 引 物:5’-GTGAAGAAGCCGAAGAAAC-3’;KCNE2 上游引物:5’-CACTTTAGCCAACTTGACGC-3’，下游引物:5’-ATACTTCTGCTGCCAATCCT-3’(北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成)，擴增產(chǎn)物分別為127和283 bp;β-actin上游引物:5’-CCCATCTATGAGGGTTAC-3’，下游引物:5’-GGAAGGTGGACAGTGAG-3’，擴增產(chǎn)物為568 bp。PCR擴增體系:取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，上、下游引物各 1 μL，酶緩沖液 5 μL，dNTPs 4 μL，Taq 酶0.5 μL，補水到50 μL。擴增條件:94 預變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環(huán);72℃延伸6 min。取PCR產(chǎn)物，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)對凝膠成像，Quantity One軟件分析后分別計算KCNE1，KCNE2與 β-actin灰度值的比值代表其相對表達量。

1.4 KCNE1、KCNE2蛋白表達的檢測 采用Western blot法。取心肌標本組織約100 mg剪切成小塊，加入1 mL的全蛋白提取液勻漿15 min，4℃、14000 r/min 離心 20 min，取上清 20 μL，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度，其余上清中按照1∶4加入上樣緩沖液，100℃加熱5 min。100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳分離KCNE1，KCNE2蛋白，50 g/L脫脂奶粉封閉，棄去封閉液后，加入一抗，棄去一抗后，用TBS洗滌10 min，共3次。棄去TBS，加入二抗，37℃孵育1 h后棄去二抗，用TBS洗滌10 min，共3次。采用增強化學發(fā)光法顯影，將膠片掃描后用 Bandscan5.0軟件進行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，定量資料用ˉx±s表示，各組間mRNA及蛋白的表達采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

假手術(shù)24 h組、1周組及4周組大鼠左心室相應部位心肌組織KCNE1、KCNE2 mRNA及蛋白均有表達，但各組間差異無統(tǒng)計學意義(mRNA:F=2.980和 0.070，P=0.068 和 0.993;蛋白:F=0.802和0.115，P=0.459 和 0.891)，故以假手術(shù) 4 周組用于比較分析。各組大鼠梗死周邊區(qū)心肌組織中KCNE1、KCNE2 mRNA和蛋白的表達水平見圖1、2及表1。

表1 各組大鼠梗死周邊區(qū)心肌組織中KCNE1、KCNE2 mRNA和蛋白的表達

3 討論

AMI后梗死周邊區(qū)心室肌細胞動作電位時程(action potential duration，APD)縮短，延遲整流鉀通道電流(delayed rectifier potassuim current，IK)密度增加以及心臟起搏通道(HCN)電流增加可能是心肌梗死后易發(fā)生心律失常的離子機制之一。Bendahhou等[3]的研究證實，將 KCNE1 與 KCNQ1、HERG(α-亞基)在體外進行共同表達，發(fā)現(xiàn)KCNE1使全細胞的電流密度升高，通道整體電導增加，電壓依賴性增強，慢激活的IK和快激活的IK增加，最終導致平臺期縮短，3相復極加速，APD時程縮短，進而誘發(fā)心律失常。KCNE2基因編碼的 β-亞單位(MiRP1蛋白)參與HCN陽離子通道的構(gòu)成并對其進行調(diào)節(jié)。有研究[4]報道KCNE2表達的增加伴隨HCN電流增快，與心律失常密切相關;研究[5]也證實了在病理狀態(tài)下，HCN通道與心律失常有關。

該研究發(fā)現(xiàn)，AMI后梗死周邊區(qū)心肌組織KCNE1、KCNE2 mRNA和蛋白表達量明顯升高，在心肌梗死1周，二者升至峰值，與已有研究[6]AMI 1周各種室性心律失常發(fā)生率最高相符。推測缺血心肌組織中KCNE1和KCNE2的表達上調(diào)，可能引起相應離子通道的動力參數(shù)發(fā)生改變，從而導致心肌細胞異常復極和自律性改變，誘導梗死后心律失常的產(chǎn)生;同時還可能通過腎上腺系統(tǒng)和腎素血管緊張素系統(tǒng)及內(nèi)皮素、缺氧等多種刺激因素調(diào)節(jié)[7]。β受體阻滯劑如比索洛爾具有抗交感神經(jīng)活性、下調(diào)血管緊張素Ⅱ水平等多種抗心律失常作用。該研究結(jié)果顯示，AMI后4周，比索洛爾組和4周組KCNE1、KCNE2的表達雖高于假手術(shù)組，但比索洛爾組低于4周組，提示比索洛爾可抑制AMI后梗死周邊區(qū)心肌組織KCNE1和KCNE2表達的上調(diào)，可能是其抗心律失常的機制之一。

[1]McCrossan ZA，Lewis A，Panaghie G，et al.MinK-related peptide 2 modulates Kv2.1 and Kv3.1 potassium channels in mammalian brain[J].J Neuro Sci，2003，23(22):8077

[2]Tsuji Y，Zicha S，Qi XY，et al.Potassium channel subunit remodeling in rabbits exposed to long-term bradycardia or tachycardia:discrete arrhythmogenic consequences related to differential delayed rectifier changes[J].Circulation，2006，113(3):345

[3]Bendahhou S，Marionneau C，Haurogne K，et al.In vitro molecular interactions and distribution of KCNE family with KCNQ1 in the human heart[J].Cardiovasc Res，2005，67(3):529

[4]Brandt MC，Endres-Becker J，Zaqidullin N，et al.Effects of KCNE2 on HCN isoforms:distinct modulation of membrane expression and single channel properties[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(1):H355

[5]Plotnikov AN，Bucchi A，Shlapakova I，et al.HCN212-channelbiologicalpacemakersmanifesting ventricular tachyarrhythmias are responsive to treatment with I(f)blockade[J].Heart Rhythm，2008，5(2):282

[6]夏爽，張玉，鄧松柏，等.大鼠缺血心肌中 KCNE1，KCNE2基因表達的變化[J].第四軍醫(yī)大學學報，2009，30(24):2974

[7]Mustapha Z，Pang L，Nattel S.Characterization of the cardiac KCNE1 gene promoter[J].Cardiovasc Res，2007，73:82