楊靜，劉永平，劉蘊，楊明峰

1 中北大學化工與環(huán)境學院，山西 太原 030051

2 中國科學院動物研究所，北京 100101

3 北京農(nóng)學院 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè) (北方) 重點開放實驗室，北京 102206

麻瘋樹分子生物學研究進展

楊靜1，劉永平1，劉蘊2，楊明峰3

1 中北大學化工與環(huán)境學院，山西 太原 030051

2 中國科學院動物研究所，北京 100101

3 北京農(nóng)學院 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè) (北方) 重點開放實驗室，北京 102206

麻瘋樹Jatropha curcas L.作為一種新興的生物柴油型能源樹種已經(jīng)得到廣泛的認可，關于它的各項研究持續(xù)升溫。文中綜述了近年來國內(nèi)外關于麻瘋樹分子生物學方面的研究進展，一是揭示麻瘋樹遺傳多樣性和系統(tǒng)分類的分子標記研究；二是全面解析麻瘋樹分子網(wǎng)絡的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組研究；三是以培育優(yōu)質(zhì)高抗品系為目標的代謝和發(fā)育調(diào)控相關基因的分離、克隆和功能研究；最后討論了目前研究的不足和麻瘋樹未來分子生物學研究的方向。

麻瘋樹，分子標記，基因組，轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組，脂肪酸合成，非生物脅迫

Abstract:Jatropha curcas L., has been widely recognized as a potential source of biodiesel. In this review, we presented several aspects about the recent progress in molecular biology of J. curcas. First, molecular markers were used to assess its genetic diversity. Second, large-scale genome, transcriptome and proteome analyses were applied for decoding itsmolecular network. Third, functional characterization of key genes involved in metabolism and regulation of plant development was performed to breed lines with higher quality or higher resistance. Finally, we discussed the limitation of current progress and then proposed the future molecular biology research on J. curcas.

Keywords:Jatropha curcas, molecular marker, genome, transcriptome, proteomics, fatty acid biosynthesis, abiotic stress

麻瘋樹 Jatropha curcas L.為大戟科(Euphorbiaceae) 麻瘋樹屬植物，又名小桐子、假花生、油桐等，多年生小喬木或灌木，成株高3~4米，多分枝，速生、幼枝粗壯，具有較強的耐干旱瘠薄能力[1-2]。原產(chǎn)中美洲，后引種到東南亞各國，分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，我國廣西、廣東、云南、四川、貴州、福建、海南等地均有栽培或野生。麻瘋樹林單年可以掛果，3年可投入生產(chǎn)，5年進入盛果期，果實采摘期長達50年，是國際上公認的最有發(fā)展?jié)摿Φ纳镔|(zhì)能源樹種之一[2-3]。

由于麻瘋樹具有作為可再生能源植物的巨大潛能，近年來國內(nèi)外利用各種分子生物學手段全面開展了關于麻瘋樹遺傳多樣性、系統(tǒng)分類、組學和功能基因等多項研究。這些研究為深入闡明麻瘋樹的生長發(fā)育機理、改善品質(zhì)、提高產(chǎn)量、最終實現(xiàn)對其果油的高效利用奠定了基礎。

1 分子標記和遺傳多樣性分析

隨著分子生物學的不斷發(fā)展，以 PCR為基礎建立起來的分子標記技術不僅有利于種質(zhì)資源和系統(tǒng)分類的研究，還有利于功能性標記基因的定位和篩選，這將更好地為生物育種提供幫助。其中主要的分子標記技術有：隨機擴增多態(tài)性DNA (Random amplified polymorphic DNA，RAPD) 標記，擴增片段長度多態(tài)性 (Amplified fragment length polymorphism，AFLP) 標記，簡單重復序列 (Simple sequence repeats，SSR) 標記，簡單重復序列區(qū)間 (Inter simple sequence repeats，ISSR) 標記，特定序列擴增區(qū)域(Sequence-characterized amplified region，SCAR)標記等。

麻瘋樹的分子標記研究主要集中在印度和中國，包括種間和種內(nèi)鑒定，鑒定的樣品最少2個，最高的224個。從Sujatha研究團隊的研究內(nèi)容我們很容易看到世界麻瘋樹分子標記研究的發(fā)展軌跡，早在2005年他們用RAPD技術來研究一個印度有毒種與一個墨西哥無毒種之間的相似度[4]，此后，他們又分別運用RAPD、ISSR和 SCAR三種技術評價印度不同地區(qū)的有毒種與墨西哥無毒種之間的遺傳多樣性，共計 42個樣本，其結論是：同一地區(qū)不同生態(tài)型的麻瘋樹變異程度很小[5]，這與我國和巴西的研究結果相似[6-7]。因此，研究人員逐漸擴大樣品的采集地，最終發(fā)現(xiàn)來自中美洲的樣本具有較高的遺傳多樣性，而非洲和印度地區(qū)的變異度則很低。隨著EST數(shù)據(jù)庫的不斷挖掘和大戟科其他物種信息的補充，36條EST-SSRs和20條基因組SSRs被用于研究來自印度尼西亞、南美、云南、海南和格林納爾等地的 45個樣本，發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域的類群變異度比同一類群的變異度大[8]?？偟膩碚f麻瘋樹的遺傳基礎較窄，在育種改良方面還需要擴大范圍，進行諸如突變、種內(nèi)/種間雜交等研究。

除了針對基因組變異的研究外，同工酶技術也是了解種群內(nèi)遺傳變異的有力工具。張煒等[9]選取云南、四川2個省區(qū)10個麻瘋樹品種，分析了它們7種酶系統(tǒng)7個位點上21個等位基因的遺傳變異，相比較而言，西南地區(qū)的麻瘋樹具有較高的遺傳多樣性，而這種多樣性與種群的地理分布無關；種群內(nèi)部雜合程度較高，推測可能存在自交不育現(xiàn)象。

2 基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學研究

2.1 基因組學

麻瘋樹有 22條染色體，是典型的二倍體生物。它的基因組大概有416 Mbp，屬于比較理想的基因組測序植物[10]。目前，SGI公司 (Synthetic Genomics Inc.) 和ACGT公司 (Asiatic Centre for Genome Technology) 運用 Sanger雙脫氧法和二代測序技術已經(jīng)能夠估計出基因組大約有400 Mbp，與水稻基因組大小差不多，并公布了完整的首個麻瘋樹基因組草圖 (http://www.acgt.asia/press/pdf/20May2009.pdf)。之后Sato小組利用周期短、費用低的雙脫氧法和最新測序綜合技術測定了麻瘋樹基因組序列，結果顯示：非冗余序列的基因組全長2.85 Mbp，包含12萬個重疊群 (Contigs) 和2.9萬個單一序列 (Singlets)，大約有 1 529個(4%) 預測編碼蛋白的基因是麻瘋樹特有的[11]。

由于葉綠體和質(zhì)體是植物合成脂肪酸的主要場所，因此麻瘋樹葉綠體基因組 (cpDNA) 也備受關注，目前公布的測序結果顯示這個閉合環(huán)狀的分子有163 856 bp長，編碼110個獨立基因(其中78個蛋白、4個rRNA和28個tRNA)，它的大小和基因排布與其他樹種相似，系統(tǒng)樹分析發(fā)現(xiàn)它與木薯的親緣關系最近[12]。這項數(shù)據(jù)還能為以葉綠體為基礎的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供相應的信息。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學

基于麻瘋樹種子油的重要價值，許多的轉(zhuǎn)錄組學研究集中在麻瘋樹種子、生殖器官等。研究人員先后從王治濤等[13]構建的麻瘋樹胚乳cDNA文庫篩選到多個與油脂代謝和逆境響應有關的功能基因，并在此后的幾年中開展了基因全長、表達模式等方面的深入研究。Natarajan等[14]從麻瘋樹發(fā)育中的種子 cDNA文庫獲得 12 084個EST序列，平均長度為576 bp，這些序列片段與油脂合成相關的許多生物功能有關。Wang等[15]用麻瘋樹的生殖器官構建了 2個 cDNA文庫，共得到9 289條平均長度為603 bp的EST序列，這些序列經(jīng)過組裝得到4 502條獨立基因序列 (UniSeqs)，選擇 50條 EST序列在葉、花和種子中的相對表達水平進行了定量分析，發(fā)現(xiàn)其中6條在1~2個麻瘋樹組織中檢測到，這些基因可能編碼高表達的油脂合成相關蛋白和轉(zhuǎn)錄因子。

為了改善逆境條件下麻瘋樹的生長狀態(tài)，Eswaran等[16]利用鹽敏感的酵母菌種篩選麻瘋樹根的cDNA文庫，從20 000個轉(zhuǎn)化子中篩選出345個陽性克隆，從中獲得32個全長基因。選擇胚胎晚期積累蛋白基因 LEA5、胞質(zhì)抗壞血酸氧化酶基因Apx1、肌動蛋白抑制蛋白基因profilin、金屬硫蛋白基因metallothionein和磷脂結合蛋白基因annexin 5個基因檢測它們在鹽脅迫下根、葉中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)它們都在脅迫2 h后發(fā)生變化，說明它們都與脅迫早期響應有關，但是在根、葉中的表達規(guī)律各異，說明在抵御脅迫時，不同的組織采取不同的抵抗機制。這些表達序列EST和相關基因的功能解析，將為麻瘋樹的育種工作提供無價的基因資源。

2.3 蛋白質(zhì)組學

麻瘋樹的蛋白質(zhì)組學研究也聚焦到油體功能和油脂的生物合成上。通過對麻瘋樹種子萌發(fā)過程中胚乳油脂變化的比較分析發(fā)現(xiàn)油脂的利用主要在萌發(fā)的早期，而且涉及到β氧化、乙醛酸循環(huán)、TCA循環(huán)、糖異生和戊糖等多個途徑[17]。Polluechai等[18]對油體的進一步研究中發(fā)現(xiàn)3個油體蛋白oleosins (JcOle1，JcOle2，JcOle3)，比較發(fā)現(xiàn) JcOle3的表達水平是其他兩個基因的 5倍，而且它呈現(xiàn)等位基因變異和內(nèi)含子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性現(xiàn)象，因此可以作為系統(tǒng)分類的標記基因和分子育種的侯選基因。除了油體，對麻瘋樹成熟種子中胚和胚乳可溶性蛋白的比較研究中發(fā)現(xiàn)它們差異蛋白集中在油脂動員、信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成以及細胞周期等幾個與種子萌發(fā)相關的途徑中，胚乳中的差異蛋白主要是與分解代謝相關的酶，負責給生長中的胚提供營養(yǎng)；而胚中的差異蛋白主要是與合成代謝相關的酶，負責利用胚乳提供的營養(yǎng)物質(zhì)為進一步生長服務[19]。

Liang等[20]等用差異蛋白質(zhì)組學技術，配合葉綠素熒光等光合參數(shù)，在低溫處理下麻瘋樹幼苗葉片中鑒定到8個有顯著變化的蛋白，其中包括與光合作用有關的ATP合成酶、FeS蛋白、過氧化氫酶 (CAT) 和谷胱甘肽還原酶 (GR) 等，并推測麻瘋樹對低溫的響應可能更多地選擇CAT途徑。

3 功能基因分析和研究

3.1 油脂合成相關基因

麻瘋樹種子含油量豐富，脂肪酸組成和菜籽油非常相似，種子中提取的生物柴油可生物降解，比傳統(tǒng)的柴油更加清潔和高效，因此幾乎所有與麻瘋樹脂肪酸合成有關的蛋白基因都得到了相應的研究。

乙酰輔酶 A 羧化酶 (Acetyl CoA carboxylase，ACCa) 廣泛存在于生物界，是催化乙酰輔酶A和羧化生成丙二酰輔酶A的生物素酶。此反應制約著脂肪酸合成第一階段的速度，屬于脂肪酸合成的限速酶。從麻瘋樹中分離得到的ACCa基因長1 149 bp，編碼383個氨基酸。將麻瘋樹幼苗分別置于pH 8.0和pH 7.0的生長環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)在pH 8.0的培養(yǎng)條件下，葉片無論發(fā)育的早期、中期和晚期ACCa的表達量更高。相應的，黑暗條件下果實中的ACCa的量也增加。如果施加高光脅迫，在果實發(fā)育的早、中和晚期ACCa的量發(fā)生顯著波動，說明ACCa基因表達與葉片和果實的生長條件和發(fā)育階段有關[21]。從麻瘋樹中分離、鑒定的各類基因信息詳見表1。

?；d體蛋白 (Acyl carrier protein，ACP)結合一系列的脂肪酸合成酶共同完成脂肪酸的碳鏈加長反應，在脂肪酸的合成過程中起核心作用。從麻瘋樹胚乳cDNA文庫中篩選分離得到的JcACP序列推測的氨基酸序列，與其他物種已知ACP氨基酸序列同源性不高，但是具有“LEEEF”和“LGLDSLDTVEVVMA”兩個保守區(qū)，這兩個區(qū)域正好是 4′-磷酸泛酰巰基乙胺輔基的結合位點，是?；d體蛋白的特征區(qū)。該基因在葉、莖和種子中表達，在根中不表達，以種子中的表達量最高，并且種子萌發(fā)后其表達量隨萌發(fā)進程遞增，在96 h時表達量達到最高，推測在種子中的這種高量表達可能與種子萌發(fā)時的代謝活動有關[22]。

酮脂酰載體蛋白合成酶 (Ketoacyl-acyl carrier protein (ACP) synthase III，KAS III) 是催化細菌或質(zhì)體中脂肪酸合成中第一個延長反應的關鍵酶，而KAS I和KAS II分別催化ACP-4∶0到ACP-16∶0和ACP-16∶0到ACP-18∶0的碳鏈延伸[23]。過量表達KAS III的煙草、擬南芥和葡萄中 C16∶0的脂肪酸量都有增加[24]。?；?ACP硫酯酶 (Acyl-acyl carrier protein (ACP)thioesterase (TE)，F(xiàn)ATB) 能夠水解?；?ACP上的硫酯，釋放出脂肪酸和ACP，是控制脂肪酸長鏈終止點的關鍵酶。研究發(fā)現(xiàn) JcKAS III和JcFATB1在基因組中都是單拷貝的，并且能夠在根、莖、葉、花和種子中表達，在種子萌發(fā)過程中基因的表達量也在逐漸增大，其中前者在根中的表達量最大，后者在種子中表達量最大[25-26]。在過量表達 JcFATB1的擬南芥中檢測到飽和脂肪酸含量增加，特別是其中的棕櫚酸的量，而不飽和脂肪酸的量下降。因此，推測JcFATB1作為一個?；?ACP硫酯酶，能夠通過提高棕櫚酸含量改變麻瘋樹種子油的組分[26]。

硬酯酰載體蛋白去飽和酶 (Stearoyl-acyl carrier protein (ACP) desaturase，SAD) 定位在質(zhì)體基質(zhì)中，主要催化硬脂酰-ACP脫飽和成油酰-ACP，是控制高等植物脂肪酸中飽和與不飽和鍵比率的，這個比率的高低與植物的許多生理功能有關，特別是與植物的抗冷性相關[27]。麻瘋樹的JcSAD的氨基酸序列與蓖麻的相似度高達96%。JcSAD在根、莖、葉、花、果皮和種子都有表達，其中果皮和種子中表達量最大。通過原核表達獲得的JcSAD，能夠?qū)⑼庠从仓?ACP轉(zhuǎn)化成油酰-ACP，具有去飽和酶活性[28]。在利用病毒誘導基因沉默 (VIGS) 方法檢測麻瘋樹包括脂肪酸合成、發(fā)育調(diào)控、毒蛋白合成相關的13個基因功能時發(fā)現(xiàn)，JcKAS II和JcFATB確實在脂肪酸鏈長和飽和/不飽和比率中起重要作用，而且JcSAD1在種子的甘油三酯積累階段表達量較高[29]。

ω3 脂 肪 酸 去 飽 和 酶 (ω3-fatty acid desaturase，F(xiàn)AD3) 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體中將二烯脂肪酸去飽和生成三烯脂肪酸的關鍵酶。三烯脂肪酸屬于多不飽和脂肪酸，是植物細胞膜的重要組成成分，葉綠體膜中的這種脂肪酸占到了總脂肪酸的80%。從擬南芥中分離得到定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的 FAD3，和定位在質(zhì)體中的 FAD7,8，其中FAD8與低溫響應有關[30-31]。從麻瘋樹中克隆得到的JcFAD7的6個外顯子 (從第2個到第7個)的大小與擬南芥的 FAD7,8是一樣的。在轉(zhuǎn)pYJcFAD7質(zhì)粒的酵母中加入亞油酸能檢測到新的C18∶3脂肪酸出現(xiàn)，且所占比例達到2.5%，說明 JcFAD7編碼的脂肪酸去飽和酶能夠在 ω3的位置上將亞油酸去飽和，但是JcFAD7的表達與溫度變化無關[32]。圖1顯示各酶在麻瘋樹脂肪酸合成途徑中的基本位置和作用。

Xu等[33]利用實時定量PCR研究麻瘋樹種子發(fā)育過程中與脂肪酸和甘油三酯合成相關的 21個油脂基因，比較全面地了解到這些基因在種子發(fā)育過程中的表達變化，為更好地研究麻瘋樹種子油脂積累提供了一些基礎數(shù)據(jù)信息。

圖1 麻瘋樹脂肪酸合成模型[27]Fig. 1 A model for fatty acid (FA) biosynthetic pathway in J. curcas[27].

磷酸烯酮式丙酮酸羧化 (Phophoenlpyuvate carboxylase，PEPcase) 主要參與植物 C4代謝途徑CO2固定作用。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)反義PEPC的轉(zhuǎn)基因大豆和水稻提高了籽粒的油脂含量[34-35]。目前，克隆到的JcPEPC屬于該基因家族中PEPC1，其蛋白為C3型PEPC，與蓖麻、陸地棉、橙、大豆、花生的氨基酸序列同源性都超過 90%[36]。推測通過反義抑制技術控制麻瘋樹PEPC基因的表達，可提高麻瘋樹種子含油量。

3.2 抗逆相關基因

3.2.1 毒蛋白基因curcin和curcin-L

不同來源的核糖體失活蛋白 (Ribosome inactivating proteins，RIPs) 在抗真菌、抗病毒和抗腫瘤方面表現(xiàn)出獨特的作用，具有十分重要的生物學功能。它們是一種能使核糖體28S rRNA的保守α莖環(huán)結構域脫嘌呤的蛋白質(zhì)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩種麻瘋樹RIP，分別是種子中的毒蛋白curcin和葉片中的逆境誘導蛋白 curcin-L。早在1976年 Stirpe等[37]就對麻瘋樹毒蛋白進行了初步分離，并將其中有活性的產(chǎn)物命名為curcin1；此后林娟等[38]對該蛋白的毒性、編碼基因以及啟動子進行了更深入的研究。curcin只在種子的胚乳中積累，且表達始于心型胚時期，成熟時達到最高[39-40]。將該基因5'側翼區(qū)620 bp (EF612739)長的片段插入pBI121載體，替換其中的 CaMV 35S啟動子，并在相應的轉(zhuǎn)基因煙草中檢測報告基因 GUS的表達情況，結果顯示該啟動子驅(qū)動的 GUS在煙草種子胚乳中特異性表達，與它調(diào)控的curcin基因表達模式相似，其作用始于心形胚時期，并持續(xù)到種子成熟[41]。

另一個 curcin-L在受脫落酸、水楊酸、干旱、高溫、低溫和 UV等脅迫誘導時在葉片中表達[40]。用 curcin-L基因 5'端 654 bp (EF612740)側翼序列替換pBI121轉(zhuǎn)煙草的實驗中，通過檢測轉(zhuǎn)基因煙草的GUS表達量證實：它在葉片中特異表達，并且響應以上 6種脅迫的誘導，其中對于PEG模擬的干旱響應最明顯[42]。這些結果拓展了我們對麻瘋樹核糖體失活蛋白的了解，不僅有毒性蛋白 curcin，還有抗逆蛋白curin-L。

3.2.2 ERF轉(zhuǎn)錄因子基因 (JcERF) 和 DREB轉(zhuǎn)錄因子基因 (JcDREB)

盡管麻瘋樹在抗旱、耐鹽、耐貧瘠等方面表現(xiàn)突出，但是要想獲得果實高產(chǎn)且含油量高的種植結果，還必須對麻瘋樹抵御生物和非生物逆境反應進行相應的研究，以期獲得耐受脅迫能力更強的植株。除了前面介紹的利用鹽敏感型酵母篩選麻瘋樹根部耐鹽基因的報道[16]以外，Tang等[43-44]先后從高鹽、干旱和低溫脅迫的幼苗葉片中克隆到了JcERF和JcDREB，研究發(fā)現(xiàn)它們均在高鹽、干旱、ABA等逆境脅迫條件下大量表達，在過量表達JcERF和JcDREB的擬南芥中顯示了比野生型更好的抗性特征，說明這兩個基因在麻瘋樹忍受非生物脅迫中起重要作用。

3.2.3 肌醇-1-磷酸合成酶基因JcMIPS

肌醇-1-磷酸合成酶 (Myo-inositol-1-phosphatesynthase，MIPS) 在真核生物中是非常保守的，可催化 6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為肌醇-1-磷酸，是肌醇生物合成的限速酶[45]。肌醇作為一種重要的滲透保護物質(zhì)不僅是植物細胞中磷元素的主要貯存形式，而且在信號轉(zhuǎn)導、保護植物免受外部逆境傷害、激素貯存與運輸?shù)确矫娑计鸬街匾饔谩Ｆ埓簩毜萚46]和Wang等[47]研究發(fā)現(xiàn)干旱、高鹽、低溫和 ABA脅迫不僅誘導 JcMIPS的表達，還能使與 JcMIPS 5′端不同缺失片段相連的 GUS報告基因在煙草葉片原生質(zhì)體中瞬時表達，說明JcMIPS對各種逆境的響應可能源于啟動子的某個核心區(qū)域的調(diào)控。

3.2.4 水通道蛋白基因JcPIP和JcPIP2

植物水通道蛋白 (Aquaporin) 是水分快速進出細胞的主要途徑。根據(jù)它們的分布和在細胞器上的定位不同將它們分為 4大類，其中最常見的就是質(zhì)膜內(nèi)膜蛋白 (Plasma membrane intrinsic protein，PIPs) 和液泡膜內(nèi)膜蛋白(Tonoplast intrinsic protein，TIPs)。從麻瘋樹中克隆到的JcPIP和JcPIP2的氨基酸序列與蓖麻、葡萄和菠菜 PIP蛋白在進化上親緣關系較近。將 JcPIP2互補 RNA (complementary RNA，cRNA) 注入非洲爪蟾卵母細胞后改變了細胞膜的水通透性，說明它具有水通道蛋白功能，它能夠在根、莖和葉中表達，但是只有JcPIP2在干旱脅迫條件下誘導表達[48]，JcPIP基因誘導表達變化不明顯[49]。

3.2.5 甜菜堿醛脫氫酶基因JcBD1

在植物、動物、細菌和藻類的許多物種中，甜菜堿作為一種無毒滲透劑，不僅能在水分虧缺時起到保護作用，還能在各種脅迫條件下維持蛋白和膜結構。甜菜堿醛脫氫酶 (Betaine aldehyde dehydrogenase，BADH) 能催化甜菜堿醛不可逆的轉(zhuǎn)變?yōu)樘鸩藟A，是甜菜堿生物合成途徑中的關鍵酶。該酶的基因JcBD1能在根、莖、葉、花和未成熟種子中表達，其中葉和莖中的表達量最高。Southern雜交分析發(fā)現(xiàn)該基因是多拷貝的，屬于一個多基因家族。在高鹽、高溫和干旱條件下，JcBD1的表達量明顯提高，表達JcBD1蛋白的大腸桿菌在高鹽環(huán)境中長勢明顯好于對照[50]。

3.2.6 細胞質(zhì)II類小熱激蛋白基因JcHSP17.5

多種脅迫環(huán)境下，生物體內(nèi)會產(chǎn)生一組分子量大小在15~42 kDa的小熱激蛋白 (Small heat shock proteins，sHSPs)，它們具有分子伴侶的功能，能夠在不依賴ATP的情況下阻止在逆境脅迫下變性蛋白的累積以及保護蛋白的正確折疊，從而減少脅迫對生物的傷害[51]。從麻瘋樹胚乳cDNA文庫中篩選到一條編碼157個氨基酸的胞質(zhì)類小熱激蛋白基因JcHSP17.5，該基因經(jīng)過在大腸桿菌以及釀酒酵母中過量表達的研究發(fā)現(xiàn)兩種重組菌在逆境下都較對照組生活力有顯著提高，有較好的耐熱和耐滲透脅迫能力，推測JcHSP17.5在麻瘋樹生長過程中可能與麻瘋樹耐熱、耐旱以及耐離子脅迫相關[52]。

3.2.7 翻譯腫瘤調(diào)節(jié)腫瘤蛋白基因JcTCTP

翻譯腫瘤調(diào)節(jié)腫瘤蛋白 (Translationally controlledtumor protein，TCTP) 基因最早是從人類腫瘤細胞中克隆到，發(fā)現(xiàn)其在翻譯水平上受到控制，因此得名[53]。目前對TCTP的研究主要集中在哺乳動物和寄生蟲中，對于植物中的 TCTP作用及其機制尚不清楚。但是在對JcTCTP表達模式的研究中發(fā)現(xiàn)它呈現(xiàn)一定的組織和時間特異性：在Ⅰ期胚乳、胚和莖中最為豐富，而在Ⅱ期胚乳和花中表達最弱[54]。它還受到高溫、NaCl和乙烯的誘導，推測可能與麻瘋樹耐高溫、耐貧瘠的特性有關[55]。

3.2.8 ADP核糖基化因子基因JcARF

ADP核糖基化因子 (ADP-ribosylation factor，ARF) 是小 G 蛋白家族 (RAS、RHO、RAB、ARF和 RAN) 的一員，它們參與諸如基因表達、細胞骨架重組和微管形成等生理活動。從麻瘋樹cDNA文庫中篩選到的JcARF，編碼的預測蛋白具有典型的 GTP結合蛋白家族特有的P 框 (GLDAAGKT)、G′框(DVGGQ)和 G 框(NKQDL)。研究發(fā)現(xiàn) JcARF在花中的表達要比在根、莖、葉、胚乳中的表達豐富得多，此外該基因還受干旱、低溫的誘導，但是對NaCl脅迫不敏感[56]。后來還發(fā)現(xiàn)，乙烯利誘導提高的表達量比干旱和低溫的誘導更加明顯，JcARF可能與植物激素參與的信號轉(zhuǎn)導有關[57]。

3.3 發(fā)育相關基因

3.3.1 DOF轉(zhuǎn)錄因子基因JcDof1-3

擬南芥中 AtCDFs (CYCLING DOF FACTOR) 是一組研究得最清楚的參與光周期反應調(diào)控開花的Dof (DNA binding with one finger)轉(zhuǎn)錄因子[58-60]。在對它們的系列研究中發(fā)現(xiàn)，過量表達 AtCDF1的轉(zhuǎn)基因擬南芥的開花時間推遲，而轉(zhuǎn)反義OsRdd1-AS (與AtCDF的同源基因)的水稻表現(xiàn)出開花推遲、植株矮小和種子變小的現(xiàn)象[61]。我們從麻瘋樹中克隆到3個Dof轉(zhuǎn)錄因子基因JcDof1-3，研究發(fā)現(xiàn)JcDof1和JcDof3的表達在長日照和短日照條件下均呈現(xiàn)有規(guī)律的生物鐘振顫，但是在3 d的連續(xù)光照后，它們的表達呈現(xiàn)JcDof1量更高，而JcDof3波峰出現(xiàn)更早的情況，在與開花調(diào)控有關的擬南芥蛋白FKF1、ZTL、ASK2、LKP2和GI的酵母雙雜交試驗中，發(fā)現(xiàn)JcDof1只與ASK2結合，而JcDof3能與ASK2和LKP2結合，說明它們可能采取不同的蛋白降解途徑來調(diào)控麻瘋樹的開花時間，推測它們在調(diào)控麻瘋樹的開花過程中扮演著既冗余又互補的角色[62-63]。如果能變麻瘋樹的持續(xù)開花/結果特性為同步開花/結果，將大大提高采收效率，為麻瘋樹的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展發(fā)展掃清道路，也是麻瘋樹育種方向之一。

3.3.2 F-Box蛋白基因JcFbl1

F-box蛋白廣泛存在于各種真核生物中，最早在酵母中研究發(fā)現(xiàn) F-box蛋白參與組成 SCF復合體，這個復合體又參與泛素降解途徑介導的信號轉(zhuǎn)導，經(jīng)過研究證明F-box蛋白一般都通過SCF復合體參與了植物生長和發(fā)育的各種重要生理過程，如激素應答、晝夜節(jié)律、光形態(tài)建成、抗逆性等。高帆等[64]從麻瘋樹胚乳cDNA文庫中篩選出一條與在動、植物生長發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用的 F-box家族序列相似的EST序列，并進一步克隆得到含有完整編碼框的 cDNA全長和基因組序列，遺憾的是該文僅對其進行了生物信息學分析和構建了真核表達載體，而對該蛋白可能參與的生理功能沒有進一步的研究和發(fā)掘。

4 小結與展望

雖然關于麻瘋樹分子生物學方面的研究逐年增加，取得了很多可喜的成績，但是不得不承認許多研究起步較晚，很多的基因組、轉(zhuǎn)錄組信息還有待進一步分析鑒定。對于功能基因的分離、克隆多限于表達模式分析和原核表達階段，對于轉(zhuǎn)基因功能驗證方面的工作開展較少，目前尚未見到油脂含量增加或是抗性提高的轉(zhuǎn)基因麻瘋樹的報道。因此，還必須對大量未知的和已知的基因和蛋白進行更為詳盡的分析和鑒定，不僅僅是通過異源轉(zhuǎn)基因植物鑒定其功能，更重要的是找到提高脂肪酸含量、提高植株抗逆性和調(diào)控植株開花時間的關鍵基因，為麻瘋樹育種和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展服務。

表1 麻瘋樹中分離鑒定的基因Table 1 Cloning and characterization of genes in J. curcas

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Received: March 24, 2010; Accepted: May 17, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA10Z138).

Corresponding author: Gongshe Yang. Tel/Fax: +86-29-87092430; E-mail: gsyang999@hotmail.com

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2006AA10Z138) 資助。

Progress in molecular biology of Jatropha curcas

Jing Yang1, Yongping Liu1, Yun Liu2, and Mingfeng Yang3

1 School of Chemical Engineering and Environment, North University of China, Taiyuan 030051, Shanxi, China

2 Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

3 Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture China, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China

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Received: November 25, 2011; Accepted: March 9, 2012

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30972333), Initial Foundation of North University of China (No.2011-2012), Research Fund for the Doctor of North University of China (No. 2011-2012), Natural Science Foundation for Young Scientists of Shanxi Province (No. 2012021029-1).

Corresponding author: Mingfeng Yang. Tel: +86-10-80797308; E-mail: mfyang@bac.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 30972333)，中北大學校基金 (No. 2011-2012)，中北大學博士啟動基金 (No. 2011-2012)，山西省自然科學青年基金 (No.2012021029-1) 資助。