遲象陽，于長(zhǎng)明，陳薇

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071

單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具，自1975年雜交瘤單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)，單克隆抗體迅速在生命科學(xué)研究和臨床檢測(cè)診斷中得到了廣泛的應(yīng)用，為許多領(lǐng)域的發(fā)展作出了不可估量的貢獻(xiàn)。目前單克隆抗體制備技術(shù)有雜交瘤技術(shù)、EBV轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)以及單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)等[1]。

傳統(tǒng)的鼠雜交瘤單克隆抗體技術(shù)的基本過程是將來源于免疫接種過的小鼠的 B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，繼而篩選出既能無限增殖又能分泌抗體的鼠雜交融合細(xì)胞，但是這種方法得到的鼠源抗體免疫原性高、半衰期短，往往臨床療效不顯著。即使是對(duì)鼠源單克隆抗體進(jìn)行完全人源化的基因工程改造，也不可能完全消除鼠源單抗的免疫原性，對(duì)臨床療效的改善依然有限[2]。

為了減少鼠雜交瘤抗體和人源化抗體的免疫原性，提高抗體生物效應(yīng)，許多研究者嘗試各種方法來獲得全人抗體。其中人雜交瘤技術(shù)是在鼠雜交瘤技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種抗體制備技術(shù)，這種方法是將免疫過的人或鼠B細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞融合從而獲得無限傳代且能分泌抗體的雜交融合細(xì)胞，該技術(shù)雖然克服了鼠雜交瘤技術(shù)免疫原性等不足，但是仍有較多局限，如人骨髓瘤細(xì)胞系非常有限、細(xì)胞融合成功率低且容易造成染色體丟失等[3]。針對(duì)于以上缺陷，研究者利用EB病毒 (Epstein-Barr Virus，EBV) 在體外能感染正常靜止的B細(xì)胞，使它們變成永生化的淋巴細(xì)胞系這一特性，制備分泌人單抗的雜交瘤細(xì)胞，即EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞技術(shù)。然而，EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞株不是惡性腫瘤細(xì)胞，較難克隆且抗體產(chǎn)量低，因而仍然沒有得到廣泛應(yīng)用[4]。

噬菌體展示技術(shù)是目前廣泛應(yīng)用的體外篩選人源抗原特異性抗體可變區(qū)基因的一種方法，噬菌體展示是將抗體DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使抗體隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)[5]。這種方法無需B細(xì)胞培養(yǎng)過程、較為簡(jiǎn)單，但是得到的抗體并非在人體中表達(dá)，可能導(dǎo)致構(gòu)象改變從而丟失抗原特異性，并且由于抗體重鏈和輕鏈隨機(jī)組合，無法保持抗體重鏈輕鏈的天然配對(duì)[6]。

除此之外，轉(zhuǎn)基因鼠抗體制備技術(shù)在破壞鼠內(nèi)源抗體基因后導(dǎo)入人抗體基因，進(jìn)而用目標(biāo)抗原免疫轉(zhuǎn)基因鼠并在其體內(nèi)表達(dá)人源抗體，這種方法得到的抗體產(chǎn)量和親和力較高，但是鼠與人類免疫系統(tǒng)組成上的差異限制了其應(yīng)用前景[7]。

近幾年來新興的單個(gè) B細(xì)胞抗體制備技術(shù)是一種體外克隆和表達(dá)單個(gè)抗原特異性 B細(xì)胞抗體基因技術(shù)，這種方法保留了輕重鏈可變區(qū)的天然配對(duì)，具有基因多樣性好、效率高、全人源、需要的細(xì)胞量少等優(yōu)勢(shì)。以下將詳細(xì)介紹單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)及其應(yīng)用。

1 單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)過程

1.1 鑒定和分離單個(gè)B細(xì)胞

抗體基因的來源隨研究目的差異而不同。Wrammert等[8]制備的抗 H1N1抗體是從外周血中分離漿細(xì)胞 (Plasma cells) 獲得；Morris等[9]則通過分離外周血單個(gè)記憶B細(xì)胞 (Memory B cells) 得到抗HIV抗體；Wardemann等[10]為研究人自身反應(yīng)抗體的結(jié)構(gòu)和規(guī)律，從正常人骨髓中分離前B細(xì)胞制備自身反應(yīng)抗體。

在樣品豐富的情況下，為提高特異性抗體得率，可以在分離B細(xì)胞之前先通過密度梯度法[11-12]，或流式細(xì)胞分選[13]從外周血中粗分離B淋巴細(xì)胞，以ELISPOT進(jìn)行抗原特異性細(xì)胞豐度的評(píng)價(jià)，從而選擇含抗原特異性抗體濃度較高的血樣進(jìn)行后續(xù)抗體制備[8,14-16]。也有文獻(xiàn)以ELISA法直接比較不同供血者的血樣中含特異性抗體的濃度，如 Gilbert等[11]利用基于細(xì)胞的ELISA技術(shù)(Cell based ELISA)估計(jì)血樣中抗腫瘤抗體的含量。

單個(gè) B細(xì)胞分離可分隨機(jī)分離和抗原特異性分離，前者只需分離B細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單，但是隨機(jī)分離適用于抗原特異性抗體濃度較高的血樣，通常來自于疫苗接種者或患者，以盡量減輕后續(xù)抗體特異性鑒定的工作量[8,17-19]。后者需分離抗原特異性B細(xì)胞，操作較復(fù)雜，尤其適合抗腫瘤抗體、自身免疫抗體等特異性抗體含量較低的情況[9-11,15]。

隨機(jī) B細(xì)胞分離的方法主要有顯微操作法(Micromanipulation)、激光捕獲顯微切割法(Laser capture microdissection，LCM)、熒光激活細(xì)胞分選法 (Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)，見表 1。顯微操作法是在鏡下用顯微操作儀人工分離 B細(xì)胞，雖然該方法無需特殊設(shè)備、操作簡(jiǎn)單但是分離效率低，且分離細(xì)胞種類有限；激光捕獲顯微切割法的基本過程是將事先經(jīng)組織化學(xué)、免疫組化或免疫熒光方法染色的樣品切片，在顯微激光切割系統(tǒng)下觀察細(xì)胞形態(tài)和染色情況并獲取單細(xì)胞群或單細(xì)胞。該方法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，定位準(zhǔn)確，能在目視下從樣品中特異挑選同類細(xì)胞乃至單一細(xì)胞并剔除雜質(zhì)成分，但是該技術(shù)制樣復(fù)雜，無法自動(dòng)化在短時(shí)間內(nèi)獲取大量單個(gè)B細(xì)胞；熒光激活細(xì)胞分選法以熒光劑和細(xì)胞分選儀為基礎(chǔ)，用激光束激發(fā)單行流動(dòng)的細(xì)胞上結(jié)合的抗體所偶聯(lián)的熒光素，根據(jù)產(chǎn)生的熒光信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析或分選。雖然操作較為復(fù)雜，對(duì)設(shè)備和樣品的要求較高，但熒光激活細(xì)胞分選能夠自動(dòng)化，從而快速準(zhǔn)確分選或分析細(xì)胞，是目前應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞分離方法之一。

目前普遍運(yùn)用于抗原特異性單個(gè) B細(xì)胞分離的方法包括：熒光標(biāo)記抗原多參數(shù)細(xì)胞分選法(Fluorochrome-labeled antigens via multiparameter，F(xiàn)ACS)、抗原標(biāo)記磁珠分選法 (Antigencoated magnetic beads)、微雕法 (Microengraving)以及細(xì)胞微陣列芯片法 (Cell-based micro-array chip systems)。熒光標(biāo)記抗原多參數(shù)細(xì)胞分選法與熒光激活細(xì)胞分選法類似，二者差異在于前者在加入用于標(biāo)記B細(xì)胞表面抗原的熒光抗體之外，還需加入熒光標(biāo)記的目標(biāo)抗原用來結(jié)合 B細(xì)胞表面的膜抗體，以分選目標(biāo)抗原特異性的 B細(xì)胞。它可以高速分析上萬個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)，此技術(shù)不僅提高分離細(xì)胞的純度，而且可以得到更多的細(xì)胞信息，分選各個(gè)時(shí)期的B細(xì)胞用于不同的研究方向。該方法具有速度快、精度高、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析分選技術(shù)?？乖瓨?biāo)記磁珠分選法基本原理是基于細(xì)胞表面目標(biāo)抗原特異性抗體能與連接有磁珠的目標(biāo)抗原相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，通過目標(biāo)抗原與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無該種表面特異性抗體的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的目標(biāo)抗原結(jié)合而沒有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。這種方法可以在幾分鐘內(nèi)從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中分離出高純度的細(xì)胞，在流式分選單細(xì)胞前可用磁珠分選法進(jìn)行預(yù)分離，但是由于磁珠影響細(xì)胞生物活性因而不利于分離后培養(yǎng)與操作；微雕法基于軟光刻 (Soft lithographic) 微陣列芯片識(shí)別、恢復(fù)和克隆產(chǎn)生抗原特異性抗體的B細(xì)胞，刺激多克隆B細(xì)胞產(chǎn)生抗體并將其逐個(gè)置于芯片孔內(nèi)，將該芯片轉(zhuǎn)印至相應(yīng)的蛋白芯片后，即可用熒光標(biāo)記的目標(biāo)抗原識(shí)別特異性抗體，進(jìn)而顯微操作將檢測(cè)到的分泌目標(biāo)抗原特異性抗體 B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行后續(xù)克隆操作。微陣列芯片法同微雕法具有高通量 (每個(gè)芯片分選細(xì)胞量高達(dá)10萬個(gè)細(xì)胞)、快速、成本低、可直接從多克隆B細(xì)胞中分選并鑒定抗體分泌B細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)。另外，Jin等[20]通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)微陣列芯片法 (Immunospot array assay on a chip，ISAAC) 高通量制備流感抗體，ISAAC法是微陣列芯片法的延伸和補(bǔ)充，該方法用包被于芯片表面的抗免疫球蛋白抗體來代替微雕法轉(zhuǎn)印蛋白芯片的過程，抗免疫球蛋白抗體能夠快速捕捉抗體分泌B細(xì)胞分泌的抗體，進(jìn)而用生物素標(biāo)記的目標(biāo)抗原識(shí)別特異性抗體，從而達(dá)到篩選并分離特異性抗體分泌 B細(xì)胞的目的。ISAAC法較微雕法另一改進(jìn)在于，前者能在同一塊芯片上篩選針對(duì)多種不同目標(biāo)抗原的特異性抗體，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過程且更加高效，是目前前景非常廣闊的分選B細(xì)胞方法。

表1 單個(gè)B細(xì)胞分選方法Table 1 Approaches of single B cell isolation

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1.2 擴(kuò)增和克隆抗體基因

經(jīng)典克隆未知抗體基因的方法比如 cDNA文庫篩選[40-41]等有著共同的弊病，即實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，周期較長(zhǎng)、工作量大。近些年來隨著 PCR技術(shù)的快速興起和成熟，單個(gè)B細(xì)胞抗體基因的擴(kuò)增和克隆也隨之發(fā)展。

細(xì)胞分選時(shí)，通常需將單個(gè)B細(xì)胞分至內(nèi)含適量細(xì)胞裂解液、RNA酶抑制劑和PCR反應(yīng)試劑的適當(dāng)容器中，如 96孔板。由于單個(gè)細(xì)胞內(nèi)RNA含量少，適當(dāng)?shù)娜萜骺梢苑奖愦笈坎僮鳌⒎乐箻悠窊p失或交叉污染。另外，不同類型B細(xì)胞抗體分泌能力差異明顯，如抗體分泌B細(xì)胞中抗體基因轉(zhuǎn)錄本含量遠(yuǎn)高于記憶B細(xì)胞，因此從抗體分泌B細(xì)胞中更容易擴(kuò)增得到抗體基因。

通常從單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增未知抗體基因，需使用合適的引物進(jìn)行巢式或半巢式逆轉(zhuǎn)錄 PCR (Nested or semi-nested RT-PCR)，該過程要求引物具有通用性、靈敏性、特異性，能避免非特異性擴(kuò)增又能擴(kuò)增出完整的抗體基因序列，因此合理設(shè)計(jì)引物序列至關(guān)重要。通常針對(duì)抗體重鏈輕鏈可變區(qū)不同前導(dǎo)序列設(shè)計(jì)前向引物的混合物，反向引物特異性互補(bǔ)于抗體恒定區(qū)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模绻蛛x和擴(kuò)增不同同種型的抗體，反向引物則是特異性互補(bǔ)于各種同種型抗體恒定區(qū)的混合物[42-45]。除此之外，為方便重疊延伸 PCR重組和酶切克隆抗體重鏈輕鏈可變區(qū)基因，前向引物5′端和反向引物3′端需要包含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。雖然該方法已被應(yīng)用證實(shí)能擴(kuò)增出部分抗體序列，但產(chǎn)物的多樣性仍受限于前向引物結(jié)合序列的非保守性，理論上是無法涵蓋所有分選到的B細(xì)胞中功能性抗體基因[9,12,15,19,25,27]。此外，這種基于混合引物的多重 PCR反應(yīng)體系復(fù)雜，在擴(kuò)增效率、特異性以及抗體基因表達(dá)譜的還原(Repertoire retrieve) 上都可能存在問題。

Ozawa 等[23]通 過 5′ RACE (5′ rapid amplification of cDNA ends) 方法成功擴(kuò)增出抗體基因編碼框5′端的完整序列，該方法通過針對(duì)不同同種型抗體恒定區(qū)保守序列的特異性反向引物序列 GSP引物混合物，直接從細(xì)胞中RT-PCR合成cDNA第一鏈，對(duì)第一鏈加多聚G尾后，繼續(xù)用一條帶有下游巢式 PCR引物互補(bǔ)序列和多聚C的前向引物AP合成第二鏈，進(jìn)而利用針對(duì)AP和恒定區(qū)保守序列的特異性引物混合物進(jìn)行兩步巢式PCR，更加特異地?cái)U(kuò)增出目的基因。傳統(tǒng)的5′ RACE法擴(kuò)增未知基因的細(xì)胞含量要求較高，Ozawa提出的單個(gè)B細(xì)胞5′ RACE材料要求少至僅需一個(gè)細(xì)胞，且可能擴(kuò)增出多種前向引物混合物 PCR的方法無法擴(kuò)增出的抗體基因，另外過程中無需純化PCR產(chǎn)物，省略了復(fù)雜的前向引物混合物，大大簡(jiǎn)化了反應(yīng)體系[14,20,22,46]。

擴(kuò)增出的抗體基因片段用重疊延伸 PCR方法連接成scFv、scAb、Fab等形式[47]，酶切將其連接至原核或真核表達(dá)載體中。Liao等[19]構(gòu)建的線性表達(dá)框 (Linear expression cassettes) 包含有抗體轉(zhuǎn)錄和翻譯所有必需的功能元件：CMV啟動(dòng)子 (CMV promoter)、抗體前導(dǎo)序列 (Ig leader sequences)、IgG1重鏈或輕鏈恒定區(qū)基因(Constant region of IgG1 heavy- or Ig light-chain)、多聚A尾 (poly(A) tail)、可替換重鏈和輕鏈可變區(qū)基因 (Substitutable VHor VLgenes)。這個(gè)方法無需克隆過程，直接轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，方便于高通量快速高效篩選鑒定和分析特異性抗體[9,14]。

對(duì)抗體基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序得到的結(jié)果，可在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫中，如IMGT V-QUEST (http://www. imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/)、 IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 評(píng)價(jià) V-D-J基因完整性，分析其插入、缺失和突變情況。

1.3 表達(dá)、篩選和鑒定抗原特異性抗體

鑒定抗體的抗原特異性和生物活性前需將攜帶有抗體基因的表達(dá)載體在相應(yīng)系統(tǒng)中表達(dá)，最簡(jiǎn)單常用的是原核表達(dá)系統(tǒng)[8,15,22,25,27]，如Escherichia coli，相較而言，真核表達(dá)系統(tǒng)尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更有利于抗體的加工修飾，其產(chǎn)物的生物活性可靠性更高[12-13,17,39,46]，常用的有HEK293和CHO等細(xì)胞系。通過親和層析和離子交換層析純化到的抗體，可通過SDS-PAGE[14]、Western blotting[9,14-15]、ELISA[16,18,32]等常規(guī)方法篩選和鑒定抗體，也可通過免疫沉淀(Immunoprecipitation)[16]、空斑法 (Plaque assay)[8]、空斑減少中和測(cè)定法 (PRNT50 assay)[8]、流式分析法 (FACS analysis)[8]、活細(xì)胞成像測(cè)定法 (Live cell imaging assays)[11]、體內(nèi)藥物活性測(cè)定法[8]等方法進(jìn)一步測(cè)定抗體與抗原的特異性、親和力以及中和活性保護(hù)活性等生物學(xué)特性。

2 單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)應(yīng)用

單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具，其在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究、疾病診斷、藥效學(xué)及臨床應(yīng)用等方面有著不可或缺的作用。近年來，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)開始興起，并逐漸得到廣泛應(yīng)用。單個(gè)B細(xì)胞抗體技術(shù)制備的單克隆抗體所具有的全人源性、自身高度特異性和均一性的特點(diǎn)在治療病原微生物感染、腫瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面顯出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和良好的應(yīng)用前景。目前單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)已廣泛應(yīng)用于以下幾方面。

2.1 病原微生物感染治療

其他抗體制備技術(shù)如噬菌體展示、轉(zhuǎn)基因鼠等只能研究有限種類的B細(xì)胞，而單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)幫助人們?cè)诓∪烁腥净蛎庖邘讉€(gè)月甚至多年后仍然能夠快速分離到記憶 B細(xì)胞制備單抗，與此同時(shí)人們能夠從基因水平更加深入了解和闡釋人類免疫系統(tǒng)機(jī)制。單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)已用于制備抵抗病原微生物感染的高度特異性人源抗體，如HIV抗體[48-50]、破傷風(fēng)抗體[51-52]、乙肝抗體[46]、流感抗體[16-17]等。Morris 等[9]從HIV-1疫苗接種者外周血中分離單個(gè)B細(xì)胞，并克隆得到能識(shí)別 HIV-1 gp41保守位點(diǎn)且中和多株HIV-1的抗體，并研究得出結(jié)論在HIV-1 gp41包被蛋白的C端存在多免疫原性靶點(diǎn)，為HIV-1疫苗設(shè)計(jì)提供幫助。Wrammert 等[8]通過單個(gè) B細(xì)胞抗體制備技術(shù)，從H1N1感染患者外周血中成功制備了針對(duì)H1N1病毒基因保守區(qū)的中和性抗體，動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用于測(cè)試的具有代表性的3株抗體在小鼠感染H1N1后70 h后仍然都能起到保護(hù)作用，并且 3株抗體能抵抗絕大多數(shù)H1N1、H5N1病毒株。Liao等[19]從單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增流感抗體基因，將其連接至線性表達(dá)框并直接轉(zhuǎn)化到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，僅用6 d從分選的24個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出9對(duì)完整的抗體基因并表達(dá)，并成功篩選到5個(gè)高親和力人流感單克隆抗體。Jin等[20]通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)微陣列芯片分選法，僅用7 d同時(shí)從一批人外周血中分別篩選出63個(gè)流感特異性抗體分泌B細(xì)胞和104個(gè)乙肝特異性抗體分泌B細(xì)胞，從中成功制備了19株流感和 45株乙肝中和性單克隆抗體。因此，單個(gè) B細(xì)胞抗體制備技術(shù)能夠高效高通量制備高親和力人單克隆抗體。

2.2 自身免疫疾病檢測(cè)和治療

在腫瘤檢測(cè)和治療方面，單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)同樣發(fā)揮著其他技術(shù)難以比肩的重大作用，Wang等[26]通過該技術(shù)發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為葡萄膜炎癥狀的玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤患者的IgH基因和T細(xì)胞受體 (TCR) 基因重排，以此建立了一種新型的高靈敏度高特異性的初期玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤檢測(cè)方法。Gilbert等[11]在單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)的基礎(chǔ)上建立了新型的基于細(xì)胞 ELISA (Cell-based ELISA) 得到對(duì)黑色素瘤細(xì)胞具有殺傷作用的抗黑色素瘤抗體，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該抗體在黑色素瘤患者體內(nèi)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在正常人體內(nèi)的含量。

2.3 人類免疫系統(tǒng)研究

單個(gè) B細(xì)胞抗體制備技術(shù)最突出的應(yīng)用在于治療和研究自身免疫性疾病和人類免疫系統(tǒng)。單個(gè) B細(xì)胞抗體制備技術(shù)能夠分離到人體內(nèi)任意時(shí)期的B細(xì)胞，使得詳細(xì)深入地研究人體免疫系統(tǒng)各個(gè)階段功能和機(jī)理成為可能。Scheel等[25]發(fā)現(xiàn)在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑液組織中存在持續(xù)激活特定B細(xì)胞的現(xiàn)象，使得滑液組織處大量漿細(xì)胞富集，由此得出結(jié)論認(rèn)為出現(xiàn)淋巴細(xì)胞滲入情況的關(guān)節(jié)炎患者，可通過早期B細(xì)胞排除治療法減輕漿細(xì)胞堆積的癥狀。Wardemann等[10]從健康人體內(nèi)克隆出單個(gè) B細(xì)胞抗體基因并對(duì)此進(jìn)行分析和研究發(fā)現(xiàn)，骨髓中初期生成的大部分B細(xì)胞都具有自身免疫特異性，從而推論在抗體發(fā)生過程中可能存在兩個(gè)排除自身免疫的檢查點(diǎn)：一個(gè)位于骨髓，另一個(gè)位于B細(xì)胞發(fā)生免疫耐受的外周組織。

從上述對(duì)單個(gè) B細(xì)胞抗體制備技術(shù)應(yīng)用簡(jiǎn)述中可以看到，單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)具有效率高、全人源、基因多樣性更豐富等優(yōu)勢(shì)。但到目前為止，單個(gè) B細(xì)胞抗體制備技術(shù)的應(yīng)用潛力還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有發(fā)揮出來，單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)仍受到一些現(xiàn)實(shí)條件的約束，如高通量 PCR抗體基因擴(kuò)增技術(shù)仍不夠完善、某些目標(biāo)抗原難以制備、合適的人源供體需求量較多等，但是在過去十年里，單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)已經(jīng)成為制備人源抗體的熱門方法，同時(shí)也促進(jìn)了包括抗體發(fā)生成熟、疫苗保護(hù)機(jī)制、疫苗開發(fā)、腫瘤及自身免疫疾病等免疫學(xué)相關(guān)研究。隨著B細(xì)胞分選技術(shù)、后續(xù) PCR擴(kuò)增基因方法以及抗體基因高通量分析鑒定等方法的成熟和完善，未來單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)將在診斷、藥效學(xué)及臨床應(yīng)用中發(fā)揮前所未有的重大作用，引領(lǐng)新型治療性抗體研究的嶄新時(shí)代。

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