蔡 蕊， 王 世 盛， 孟 昱， 孟 慶 剛， 趙 偉 杰＊

(1.大連理工大學(xué) 制藥科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

0 引 言

在制藥行業(yè)，對藥品生產(chǎn)原料的嚴(yán)格質(zhì)量控制是確保藥品質(zhì)量的重要前提.傳統(tǒng)的質(zhì)量控制方法是將原料從原料倉庫中取出，送到分析中心或化驗(yàn)室進(jìn)行定性定量分析，再反饋到原料倉庫，合格后才允許發(fā)放，耗時較長，無法達(dá)到及時控制質(zhì)量的目的.過程分析技術(shù)(process analytical technology，PAT)，可通過在生產(chǎn)過程中對產(chǎn)品進(jìn)行及時檢測而達(dá)到實(shí)時監(jiān)控質(zhì)量的目的，而無需等到最后環(huán)節(jié)的成品檢驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)控[1～5].美國食品藥品管理局(FDA)也鼓勵制藥企業(yè)將過程分析技術(shù)作為現(xiàn)行生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(cGMP)，并廣泛地應(yīng)用到藥品生產(chǎn)過程中[6].由于NIR光譜(near infrared spectroscopy)具有穿透力強(qiáng)、無需樣品預(yù)處理、無損、可遠(yuǎn)距離檢測(光纖)等特點(diǎn)，在藥品質(zhì)量控制、真?zhèn)舞b別方面已有廣泛的應(yīng)用[7、8]，已成為一種重要的在生產(chǎn)過程中使用的過程分析技術(shù)[9].NIR光譜的應(yīng)用，使得原料鑒別、檢驗(yàn)工作可以直接在存儲車間倉庫或卸貨現(xiàn)場進(jìn)行，甚至無需打開樣品內(nèi)包裝，檢測時間只需幾秒鐘.但目前，該技術(shù)僅被少數(shù)國外制藥企業(yè)用于原料進(jìn)貨入場驗(yàn)收時的質(zhì)量鑒別、原料投放前的質(zhì)量分析，混合、干燥、壓片、包衣等過程檢測及終產(chǎn)品原位無損分析[10、11]，并且對降糖原料藥的定性分析，尚未見報(bào)道.本文結(jié)合第一范圍標(biāo)定法對降糖原料藥NIR定性分析的可行性進(jìn)行研究，試圖建立一種快速、準(zhǔn)確、無需樣品預(yù)處理的鑒定8種降糖原料藥的方法，以期為制藥企業(yè)對降糖原料藥進(jìn)貨驗(yàn)收和投料前的品種鑒別提供新型的檢測手段.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

MPA型傅里葉變換近紅外光譜儀(德國BRUKER公司)，配有積分球漫反射采樣系統(tǒng)、RT－PbS檢測器、樣品轉(zhuǎn)輪、透過單元、光纖探頭測樣器－銦鎵砷(InGaAs)檢測器、OPUS 6.5操作軟件.

降糖原料藥鹽酸二甲雙胍、鹽酸吡格列酮、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈、格列本脲、格列齊特、格列吡嗪，每個品種各10批次，均由輝瑞制藥有限公司大連工廠提供.

1.2 近紅外光譜采集

8種降糖原料藥固態(tài)粉末的近紅外光譜圖采集(見圖1):取鹽酸二甲雙胍、鹽酸吡格列酮、格列吡嗪、格列齊特、格列美脲、格列喹酮和瑞格列奈原料粉末(無需去除聚乙烯塑料包裝)，使用漫反射光纖探頭壓住藥粉，在12 500～4 000cm－1進(jìn)行光譜采集，光譜分辨率為8cm－1，樣品掃描次數(shù)為16次，背景掃描次數(shù)為16次，溫度23～25℃，溫度變化每小時不超過1℃，一天不超過2℃.

8種降糖原料藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液的近紅外光譜圖采集:配制鹽酸二甲雙胍、鹽酸吡格列酮、格列吡嗪、格列齊特、格列美脲、格列喹酮、格列本脲和瑞格列奈的最大濃度溶液(鹽酸二甲雙胍濃度為20 mg／mL；鹽酸吡格列酮、格列齊特和格列本脲濃度為10mg／mL；格列喹酮和瑞格列奈濃度為5 mg／mL；格列吡嗪和格列美脲濃度為2mg／mL)，裝入石英液體樣品池中，采用透射方式在12 500～4 000cm－1進(jìn)行光譜采集，除光譜分辨率為16 cm－1外，其他參數(shù)同上.

圖1 固態(tài)降糖原料藥的近紅外光譜圖Fig.1 NIR spectra of solid oral hypoglycemic APIs

1.3 光譜預(yù)處理方法

掃描共得到96張光譜圖，其中64張光譜圖作為訓(xùn)練樣品集進(jìn)行模型的建立.采集8種降糖原料藥標(biāo)準(zhǔn)品固態(tài)粉末的近紅外光譜圖時，由于樣品顆粒大小、均勻性、儀器狀態(tài)等因素的影響，光譜基線會產(chǎn)生偏差或漂移，為消除這些不良影響，原始光譜圖需要經(jīng)過預(yù)處理.常用的預(yù)處理方法有消除常數(shù)偏移量、減去一條直線、矢量歸一化、最?。畲髿w一化、多元散射校正、內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、一階導(dǎo)數(shù)＋減去一條直線、一階導(dǎo)數(shù)＋矢量歸一化、一階導(dǎo)數(shù)＋MSC，共11種.而后以得到最大的選擇性S(至少大于2，越大越好)為目標(biāo)，選擇最佳波數(shù)范圍、算法進(jìn)行建模.

2 結(jié)果與討論

2.1 處理方法

定性分析的目的是判定測試譜圖與庫中參考譜圖的差別.必須先定義測試譜圖相似性的方法，以及一個閾值.這個閾值用來判定一張譜圖是否與參考譜圖相似或相同.

標(biāo)準(zhǔn)算法和因子法是定性分析時常用的兩種基本算法，分析過程中，兩種算法將測試譜圖同所有參考譜圖進(jìn)行比較.比較結(jié)果即是匹配值，也對應(yīng)為光譜圖距離D.兩張譜圖越匹配，則距離越短.完全相同的譜圖匹配值為零(例如:參考譜圖對自己測試).

標(biāo)準(zhǔn)算法是用歐氏距離D來計(jì)算光譜圖距離，計(jì)算公式為

通過歐氏距離來比較譜圖的匹配度，a(k)和b(k)是譜圖A、B的縱坐標(biāo)值，即光譜強(qiáng)度.

因子法是先將譜圖表示為因子譜的線性組合，a＝T1af1＋T2af2＋T3af3＋…，fi為因子譜，各因子譜正交，T為每一個因子譜的系數(shù)，其數(shù)值表征相應(yīng)因子譜對所表征譜圖的貢獻(xiàn).再用因子T(也稱得分)來計(jì)算光譜圖距離，公式為

然后計(jì)算各品種訓(xùn)練集中每一樣品光譜圖到該樣品平均光譜圖的距離(H)，并據(jù)此計(jì)算每一樣品的閾值(DT):

其中max(H)為測定的樣品光譜圖中到該樣品平均光譜圖的最大距離；Sdev為H的標(biāo)準(zhǔn)偏差；X為系數(shù)，一般根據(jù)經(jīng)驗(yàn)X選用0.25.使用上述公式來比較譜圖的匹配度.

選第一范圍標(biāo)定法則光譜圖距離的最小和最大值由第一頻率范圍決定.然后計(jì)算其他頻率范圍的距離，其值按相同范圍標(biāo)定，也就是與第一頻率范圍同樣的最小和最大值.第一范圍標(biāo)定法與標(biāo)準(zhǔn)算法和因子法不同，重疊譜區(qū)沒有合在一起.例如:如果設(shè)定第一頻率區(qū)間為1 500～1 200 cm－1、第二區(qū)間為1 500～1 400cm－1，它們不會組合成一個頻率范圍，計(jì)算光譜圖距離時1 500～1 400cm－1的數(shù)據(jù)點(diǎn)被使用兩次.矢量歸一化預(yù)處理方法不能與第一范圍標(biāo)定法一起使用；因?yàn)樗亲詣舆M(jìn)行的.與標(biāo)準(zhǔn)算法和因子法相反，矢量歸一化是對每個頻率范圍單獨(dú)計(jì)算的，然后從這些值中計(jì)算出平均距離.

標(biāo)準(zhǔn)算法是用歐氏距離表示光譜圖距離，而第一范圍標(biāo)定法使用相關(guān)因子.

計(jì)算Pearson相關(guān)因子r，即測出譜圖A和B之間的相關(guān)性:

對每一個頻率范圍分別計(jì)算相關(guān)性.對某一頻率范圍全部數(shù)據(jù)點(diǎn)k求和:an和bn是歸一化的譜圖強(qiáng)度，由歸一化步驟得到

式中:am和bm是響應(yīng)頻率范圍的平均光譜強(qiáng)度；相關(guān)因子r的范圍在－1(譜圖相反)到＋1(譜圖相同)之間.

相關(guān)因子按照下式變換成光譜圖距離:

光譜圖距離D值落在0(譜圖相同)和2 000(譜圖相反)之間.

模型的結(jié)果一方面看所有建模光譜圖是否被唯一鑒定，另一方面還要看不同庫之間的選擇性，一般用S表示:

S為選擇性，D是兩個庫平均光譜之間距離，T1與T2為兩個庫的閾值.S＜1:類交叉；S＝1:類之間有接觸；S＞2:類之間可以完全分開，因此S越大，類之間差別越大，模型預(yù)測的準(zhǔn)確性越高.根據(jù)實(shí)驗(yàn)效果，選取合適的算法.

在建立8種降糖原料藥固態(tài)模型時，將采集到的原始光譜圖進(jìn)行各種不同預(yù)處理方法和分析方法的調(diào)試，初選定波譜范圍12 072.3～4 000.0 cm－1，選擇最優(yōu)參數(shù)，確定的最優(yōu)光譜預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù)，分析方法為第一范圍標(biāo)定法.

在建立8種降糖原料藥溶液的近紅外光譜模型時，需將原料藥溶解，由于溶劑甲醇的吸收很強(qiáng)，原始譜圖所顯示的信息，除幾處有細(xì)小的差別外，用肉眼無法辨別其與甲醇的吸收譜圖的區(qū)別(如圖2、3所示)，必須經(jīng)過光譜預(yù)處理方法對譜圖進(jìn)行預(yù)處理，選擇較好的結(jié)果，建立定性分析模型.經(jīng)過調(diào)試，選定掃描波譜范圍10 235.7～4 237.2cm－1，確定最優(yōu)預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù)，分析方法為第一范圍標(biāo)定法.

圖2 液態(tài)降糖原料藥的近紅外光譜圖Fig.2 NIR spectra of liquid oral hypoglycemic APIs

圖3 純甲醇溶劑的近紅外光譜圖Fig.3 NIR spectra of pure methanol solvent

2.2 定性模型的建立

采用近紅外漫反射光譜法對8種固態(tài)降糖原料藥建立定性分析方法，在掃描譜區(qū)范圍12 072.3～4 000.0cm－1，使用一階導(dǎo)數(shù)，結(jié)合第一范圍標(biāo)定法進(jìn)行建模.將8種降糖原料藥配制成對應(yīng)濃度的溶液，采用近紅外透射光譜法對其建立定性分析方法，在掃描譜區(qū)范圍10 235.7～4 237.2cm－1，使用一階導(dǎo)數(shù)，結(jié)合第一范圍標(biāo)定法，建立其分析模型.

對固態(tài)、液態(tài)的降糖原料藥進(jìn)行NIR定性分析，從表1中可以看出，固態(tài)模型的S均大于149.161，遠(yuǎn)大于2，說明該模型可將固態(tài)原料完全地分離；從表2中可以看出，有6種溶液的S大于2，另外2種的S在1和2之間，這說明格列吡嗪、格列喹酮的甲醇溶液應(yīng)用近紅外光譜法鑒別結(jié)果并未得到完全的分離，可能是因?yàn)?種降糖原料藥在甲醇中的溶解度有限，無法達(dá)到一定的濃度，甲醇溶劑在9 000～4 000cm－1都有很強(qiáng)的吸收，被檢測組分濃度過低則受到甲醇吸收峰的干擾更為顯著，無法體現(xiàn)特征信號，致使計(jì)算結(jié)果不如固態(tài)模型的好.因此，相比固態(tài)降糖原料藥模型，液態(tài)降糖原料藥的定性模型結(jié)果較差.

表1 固態(tài)降糖原料藥定性模型建立結(jié)果Tab.1 The qualitative model results of solid oral hypoglycemic APIs

表2 液態(tài)降糖原料藥定性模型建立結(jié)果Tab.2 The qualitative model results of liquid oral hypoglycemic APIs

2.3 模型的驗(yàn)證

8種固態(tài)降糖原料藥定性分析模型的驗(yàn)證:取8種原料藥樣品，利用已經(jīng)建立好的模型對未知樣品進(jìn)行近紅外定性分析，當(dāng)匹配值(測試光譜圖與參考光譜圖之間的光譜圖距離)小于相應(yīng)的閾值，而且所有其他物質(zhì)的匹配值都大于相應(yīng)的閾值時，說明被成功鑒定.以一種降糖藥為例，分析結(jié)果如表3所示，未知樣品1只有與鹽酸二甲雙胍匹配時匹配值小于閾值，因此被鑒定為鹽酸二甲雙胍.

表3 未知樣品1的定性評價(jià)結(jié)果Tab.3 The qualitative evaluation result of unknown Sample 1

8種降糖原料藥溶液的近紅外分析模型的驗(yàn)證方法同上，未知樣品均被鑒定成功，說明此定性模型可以對8種降糖原料藥進(jìn)行定性分析.

3 結(jié) 論

應(yīng)用近紅外光譜法結(jié)合第一范圍標(biāo)定法，建立了8種降糖原料藥(鹽酸二甲雙胍、鹽酸吡格列酮、格列吡嗪、格列齊特、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈、格列本脲)的定性模型，使用固體光纖及液態(tài)透射方式采集譜圖，分別在12 072.3～4 000.0cm－1、10 235.7～4 237.2cm－1，建 立NIR 8種降糖原料藥固態(tài)及液態(tài)的定性分析模型，兩個模型對未知原料藥的鑒別結(jié)果準(zhǔn)確率均為100%，固態(tài)分析模型得到的鑒別結(jié)果要好于液態(tài)模型.結(jié)果表明所建立的模型可以實(shí)現(xiàn)對8種降糖原料藥快速準(zhǔn)確的鑒別，比傳統(tǒng)檢測方法更加快速、簡便，適用于制藥企業(yè)在原料進(jìn)廠、車間投料前逐桶定性鑒別，擴(kuò)大了NIR在生產(chǎn)過程前端的應(yīng)用，為降糖原料藥質(zhì)量控制提供簡便、可靠的過程分析技術(shù).

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