劉 銅， 侯巨梅， 陳 捷， 荊 晶， 王玉瑩， 左豫虎＊

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

由新月彎孢［Curvularia lunata（Wakker）Boed］引起的玉米彎孢葉斑病已成為玉米上一種重要的葉部病害，對我國玉米生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失［1－4］。目前對該菌研究主要集中在致病性分化與變異和致病機(jī)理等方面［5－6］。在對致病機(jī)理研究過程中，利用突變體或同源克隆方法分離與克隆了一些致病相關(guān)基因，需要進(jìn)行基因功能的研究。遺傳轉(zhuǎn)化體系是對基因功能研究的主要方法之一，然而目前玉米彎孢葉斑病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系除了ATMT外［7］，并沒有對其他的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行系統(tǒng)的研究，特別是PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。

PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系是利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）作為原生質(zhì)體的誘導(dǎo)劑，它可使細(xì)胞膜之間或外源DNA與膜之間形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連，并可通過改變細(xì)胞膜表面的電荷，引起細(xì)胞膜通透性的改變，從而可以使外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體，隨機(jī)插入并整合到染色體上，完成基因置換和互補(bǔ)。由于該方法具有操作相對簡便、DNA分子易于進(jìn)入、轉(zhuǎn)化子純合性好等優(yōu)點(diǎn)，它已在絲狀真菌基因功能研究中發(fā)揮著重要作用［8］。因此本研究擬建立玉米彎孢葉斑病菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系，為開展該菌致病相關(guān)基因克隆和基因功能研究提供一種手段。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

玉米彎孢葉斑病菌（C.lunata）作為轉(zhuǎn)化受體。質(zhì)粒pV2作為轉(zhuǎn)化供體，它具有潮霉素抗性基因（HyB）標(biāo)記和氨芐青霉素抗性基因（Amp）標(biāo)記，有HindⅢ等多種限制酶的單酶切位點(diǎn)。

1.2 培養(yǎng)基及緩沖液

1.2.1 菌絲培養(yǎng)基

馬鈴薯200g，葡萄糖20g，酵母膏15g。

1.2.2 原生質(zhì)固體再生培養(yǎng)基

NaNO32g，K2HPO41g，KCl 52g，MgSO4·7H2O 0.05g，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg，蔗糖20g，瓊脂18g。

1.2.3 酶解緩沖液

pH 5.6檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液配制的0.7mol／L KCl溶液。

1.3 主要試劑

溶壁酶購自廣州微生物所；纖維素酶、崩潰酶和蝸牛酶均購自Sigma公司；RnaseA（濃度為10mg／mL）、氨芐青霉素、Tris飽和酚購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ購自北京經(jīng)科宏達(dá)；Southern blotting試劑盒購自美國GE Healthcare公司；氯仿、異戊醇、瓊脂粉等其他常用試劑均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 質(zhì)粒提取

取Amp抗生素生長到對數(shù)生長期的細(xì)菌培養(yǎng)液于1.5mL 微量 離 心 管 中，8 000r／min 離 心1min，留沉淀提取質(zhì)粒，具體操作參照試劑盒方法。

1.5 原生質(zhì)體制備

新月彎孢于PDA平板上28℃培養(yǎng)7d，加入無菌水用滅菌鉤刮下孢子使其混勻，調(diào)整孢子懸浮液的濃度達(dá)到106cfu／mL。取孢子懸浮液1mL加入到100mL的菌絲培養(yǎng)基中，置于30℃、120r／min的搖床上振蕩培養(yǎng)20h，取出后用三層擦鏡紙過濾，并用酶解緩沖液沖洗菌絲，收集菌絲體。

將上述得到的菌絲按1∶10（W／V）加至50mL離心管酶液中，置于30℃、100r／min的水浴搖床上酶解。取酶解懸浮液滴于血球計(jì)數(shù)板上，置于顯微鏡下觀察計(jì)算，得出原生質(zhì)的產(chǎn)量。然后用3層擦鏡紙過濾原生質(zhì)體，濾液在4℃、4 000r／min離心15min，棄上清，沉淀用 Wash buffer 1（0.7mol／L KCl，50mmol／L CaCl2）清洗2次；然后加入適量Wash buffer 2（1.0mol／L 甘露醇，10mmol／L Tris－HCl，pH 7.5，50mmol／L CaCl2）溶液，混勻，調(diào)原生質(zhì)體濃度至107cfu／mL待用。

細(xì)胞壁降解酶對原生質(zhì)體制備的影響：以1%溶壁酶、1%溶壁酶＋1%崩潰酶、1%溶壁酶＋1%纖維素酶、1%溶壁酶＋1%纖維素酶＋1%蝸牛酶、1%溶壁酶＋1%崩潰酶＋1%纖維素酶5種不同酶系組合，比較不同酶系統(tǒng)對原生質(zhì)制備的影響，確定酶解菌絲細(xì)胞壁的最佳酶系統(tǒng)。其他固定條件為：酶解溶液為pH 5.6檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液，菌齡為20h，酶解溫度為30℃，酶解時(shí)間為4h。

1.6 原生質(zhì)體再生

取出酶解原生質(zhì)體用三層擦鏡紙過濾，濾液于4℃、4 000r／min離心15min，棄上清，沉淀用Wash buffer 1清洗2次；將獲得的原生質(zhì)體稀釋到102cfu／mL，取1mL含原生質(zhì)體的液體培養(yǎng)基與20mL熱融并冷卻至45℃的含相應(yīng)原生質(zhì)體固體再生培養(yǎng)基混合，并迅速輕輕搖動，使原生質(zhì)體均勻分布于培養(yǎng)基中，待凝固后封口，在25℃倒置培養(yǎng)5d，對形成的菌落數(shù)計(jì)數(shù)（A），以不含穩(wěn)滲劑再生培養(yǎng)基作對照（B），重復(fù)3次，求平均值，計(jì)算再生率。再生率公式：再生率（%）＝（A－B）×100／總原生質(zhì)體數(shù)。

1.7 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

在50mL離心管中加入180μL原生質(zhì)體，在冰上放置20min后，加入質(zhì)粒20μL（20μg），冰浴30min后緩慢向管中加入300μL 40%PEG，分3次加完，冰浴20min；然后將離心管取出，在28℃下放置20min。最后將200μL混合物平鋪于含200μg／mL潮霉素B原生質(zhì)體固體再生培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)7d，將能夠抗潮霉素的菌落轉(zhuǎn)移到預(yù)先倒好的含有潮霉素的固體PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行二次篩選，得到的菌株即為突變株。

1.8 DNA提取與PCR檢測

CTAB法提取基因組DNA，其方法參見文獻(xiàn)［9］。PCR反應(yīng)體系（25μL）：Premix Taq 12.5μL，DNA模板1μL，引物 hyg－F：5′－CGACAGCGTCTCCGACCTGA－3′和 hyg－R：5′－CGCCCAAGCTGCATCATCGAA－3′各1μL，ddH2O 9.5μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃5min，94℃1min，55℃45s，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃5min；1.0%瓊脂糖電泳檢測。

1.9 Southern blotting分析

Southern blotting分析根據(jù)Southern blotting試劑盒操作說明進(jìn)行。采用HindⅢ限制性內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行酶切，300μL酶切體系中含20μg DNA，8μL 限制性內(nèi)切酶，30μL 10×Buffer。37℃，酶切過夜。Southern雜交溫度為55℃。以潮霉素基因片段（811bp）為探針進(jìn)行標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體制備與再生

新月彎孢菌絲被加入裂解酶液后，最初1～2h無原生質(zhì)體釋放，但菌絲出現(xiàn)了斷裂，頂端聚集膨大，隨著裂解時(shí)間的延長，菌絲的頂端開始釋放原生質(zhì)體；在釋放中期，菌絲以斷裂為主，釋放不規(guī)則圓形的原生質(zhì)體，釋放的高峰在3～4h之間，在大約5h后，基本釋放完成。不同組成的酶系影響了原生質(zhì)體產(chǎn)量，用溶壁酶與另外3種酶相互組合進(jìn)行菌絲的破壁處理，均可產(chǎn)生一定量的原生質(zhì)體，其效果優(yōu)于單一溶壁酶。當(dāng)1%溶壁酶＋1%蝸牛酶＋1%纖維素混合酶可以產(chǎn)生原生質(zhì)體6.78×108cfu／mL，再生率達(dá)27%。其結(jié)果如表1。

表1 酶系對原生質(zhì)體釋放的影響

2.2 轉(zhuǎn)化子的獲得

經(jīng)PEG轉(zhuǎn)化后，在再生培養(yǎng)基上獲得新月彎孢再生菌落，將其轉(zhuǎn)接到含200μg／mL潮霉素的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行二次篩選，然后將穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子在不含潮霉素PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)傳代5次后，再移入含200μg／mL潮霉素的PDA培養(yǎng)基，獲得16個能夠正常生長轉(zhuǎn)化子，初步確定為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。

2.3 轉(zhuǎn)化子PCR

隨機(jī)挑取5個穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子，分別提取它們的總DNA，根據(jù)已知潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hyg－F和hyg－R引物進(jìn)行了PCR檢測。5個突變株均能擴(kuò)增出潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的譜帶（811bp）（圖1），表明質(zhì)?？赡艹晒Σ迦胪蛔冎曛校霭l(fā)菌沒有擴(kuò)增出潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的譜帶，證明在出發(fā)菌中不存在潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的序列，沒有質(zhì)粒的整合。

圖1 對隨機(jī)挑取的5個轉(zhuǎn)化子中潮霉素基因分析

2.4 Southern blotting檢測

為了進(jìn)一步確定質(zhì)粒pV2已成功插入突變株中，以潮霉素基因片段（811bp）為探針對所獲得5個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern blotting檢測，發(fā)現(xiàn)5個轉(zhuǎn)化子均出現(xiàn)了條帶，結(jié)果進(jìn)一步表明質(zhì)粒pV2已經(jīng)插入新月彎孢基因組中（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)化子Southern blotting分析

3 討論

PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所采用的材料是原生質(zhì)體，所以原生質(zhì)體制備成為遺傳轉(zhuǎn)化過程中的一個重要環(huán)節(jié)，原生質(zhì)體質(zhì)量的好壞直接影響著轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的成功與否，它是開展PEG轉(zhuǎn)化工作的關(guān)鍵［10］。制備高質(zhì)量的原生質(zhì)體，需選擇適合的溶菌酶，對受體菌的菌齡、酶解時(shí)間、酶解溫度等均要進(jìn)行摸索［11－12］。王賡等［13］在對新月彎孢的原生質(zhì)體制備過程中發(fā)現(xiàn)，在30℃條件下，將培養(yǎng)16h的彎孢菌絲用溶壁酶和纖維酶的混合酶液酶解4h，原生質(zhì)體釋放量達(dá)到6.0×106個／mL，原生質(zhì)體再生率為2.7%。黃世文等［14］對新月彎孢原生質(zhì)體的制備過程中一些影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)18h的菌絲，以0.7mol／L KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，30℃下經(jīng)過2%溶壁酶＋4%纖維素酶混合酶液（pH5.8）酶解4h，原生質(zhì)體在靜止條件下最大釋放量達(dá)到1.7×106個／mL，再生率為0.76%。另有研究報(bào)道，制備原生質(zhì)體一般要求使用新鮮萌發(fā)孢子，用冷藏過的細(xì)胞制備原生質(zhì)體時(shí)，轉(zhuǎn)化效率明顯下降［15］。因此，獲得大量原生質(zhì)體是成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)篩選了裂解酶種類，提高了對菌絲的裂解，獲得了更多的原生質(zhì)體，增加轉(zhuǎn)化率。

本研究成功運(yùn)用PEG介導(dǎo)的玉米彎孢霉葉斑病菌的遺傳轉(zhuǎn)化，以完整的質(zhì)粒隨機(jī)插入受體菌基因組中，從而可以導(dǎo)致相應(yīng)功能的喪失或減弱或某些調(diào)控基因表達(dá)增強(qiáng)或帶上選擇標(biāo)記，有利于對功能基因的克隆與定位，同時(shí)也有利于DNA的交換，為開展玉米彎孢葉斑病菌基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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