宋 敏，趙樹銘，劉鳳君，郭 輝，蔣天倫△

（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院，1：輸血科；2：檢驗(yàn)科，重慶 400038）

近年來，隨著人們生活水平和醫(yī)療保障水平的不斷提高，輸血的安全性問題，越來越受到公眾的重視和關(guān)注，雖然對(duì)獻(xiàn)血員都進(jìn)行了篩選，但是由于當(dāng)前科技水平的限制，檢測(cè)方法較為局限，存在病毒標(biāo)記物檢測(cè)技術(shù)的局限性、窗口期、試劑敏感性、檢測(cè)病毒種類的局限性等［1］，血液輸注仍無法達(dá)到“零風(fēng)險(xiǎn)”。由于有些病毒顆粒片段存在于血漿中［2］，輸注血漿傳播某些傳染病的可能性高于全血，故對(duì)血漿進(jìn)行病毒滅活是當(dāng)前提高輸血安全性的重要措施。目前已有的血漿病毒滅活方法很多［3］，但對(duì)于單袋血漿病毒滅活最常用的是亞甲藍(lán)（MB）光化學(xué)法血漿病毒滅活［4－5］，該方法現(xiàn)已在我國(guó)多家血站實(shí)行。據(jù)報(bào)道，MB光化學(xué)血漿病毒滅活方法幾乎可以滅活所有細(xì)胞外的含脂薄膜病毒，如可經(jīng)血液傳播的艾滋病毒（HIV），乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV）等［6］，但對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的病毒不具滅活作用，因此，在采用該方法進(jìn)行血漿病毒滅活的同時(shí)，還需濾除血液中的白細(xì)胞［7］。但是，如果經(jīng)過病毒滅活處理后，雖然殺滅或去除了可能存在的病毒，但卻對(duì)其中的有效血液成分的活性和（或）活力造成嚴(yán)重?fù)p傷，那就失去了病毒滅活的意義。尤其是現(xiàn)已證明冷沉淀是所有血液成分中病毒含量最高的［2］，用病毒滅活血漿制備冷沉淀就顯得尤為重要了?；诖耍狙芯繉?duì)冷沉淀的主要有效成分且對(duì)病毒滅活較為敏感的凝血因子Ⅷ（FⅧ）及纖維蛋白原（Fib）進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 日本藍(lán)橋血凝儀（Sysmex CA－7000），淄博中?？滇t(yī)用病毒滅活柜（ZBK－YBM－01），BECKMAN 低溫離心機(jī)（Jb－MC Centrifuge），SANYO速凍冰箱（CFC－free型），四聯(lián)采血袋（南京賽爾金），含有MB添加元件的病毒滅活柜配套一次性病毒滅活血袋（淄博中?？担現(xiàn)ib檢測(cè)試劑（德國(guó) Marburg Lot：537511），F(xiàn)Ⅷ：C（FⅧ活性）檢測(cè)試劑（德國(guó) Marburg Lot：500881B）。

1.2 標(biāo)本來源 均來自本血站街頭無償獻(xiàn)血血液標(biāo)本。隨機(jī)抽取16袋400mL全血，于6h內(nèi)進(jìn)行血液成分分離。將所得血漿充分混勻后無菌等量分裝于兩個(gè)相同空血袋內(nèi)，熱合封口后分別歸為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。同時(shí)留取血漿小辮子一份，做好標(biāo)記用于檢測(cè)FⅧ及Fib。整個(gè)操作過程嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）文件（根據(jù)《血站質(zhì)量管理規(guī)范》制定）要求進(jìn)行。

1.3 血漿病毒滅活處理 采用一次性病毒滅活血袋對(duì)血漿進(jìn)行病毒滅活處理主要有兩個(gè)步驟：光照及過濾。作者通過無菌操作將兩組血漿與一次性血漿病毒滅活專用血袋相連，其中實(shí)驗(yàn)組血漿中加入 MB（濃度1μmol／L），對(duì)照組血漿中不加入MB，兩組血漿同時(shí)放入病毒滅活輻照箱內(nèi)進(jìn)行光照處理（光照強(qiáng)度25 000～30 000 1ux，溫度5～10℃，擺動(dòng)頻率60次／分鐘條件下作用30min），光照后分別留取血漿小辮子一份，做好標(biāo)記用于檢測(cè)FⅧ及Fib；按要求過濾后再分別留取血漿小辮子一份，做好標(biāo)記備檢。將三組備檢小辮子立即放于－50℃冰箱速凍。整個(gè)操作過程嚴(yán)格按照SOP文件（根據(jù)《血站質(zhì)量管理規(guī)范》制定）要求進(jìn)行。

1.4 凝血因子檢測(cè) 3d后，于－50℃冰箱取出三組小辮子，37℃水浴箱中復(fù)溶后，立即檢測(cè)FⅧ及Fib。Sysmex CA－7000血凝儀檢測(cè)原理為免疫比濁法。檢測(cè)過程嚴(yán)格按照凝血因子檢測(cè)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果在SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件上進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組FⅧ：C及Fib濃度病毒滅活處理前后、光照前后變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、2，兩組過濾前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表1 兩組血漿病毒滅活處理前后凝血因子減少值（±s）

表1 兩組血漿病毒滅活處理前后凝血因子減少值（±s）

組別 n FⅧ：C（%） Fib（g／L）對(duì)照組16 4.54±7.58 0.05±0.069實(shí)驗(yàn)組16 32.81±10.47 1.06±0.260

表2 兩組血漿光照前后凝血因子減少值（±s）

表2 兩組血漿光照前后凝血因子減少值（±s）

組別 n FⅧ：C（%） Fib（g／L）對(duì)照組16 4.27±8.22 0.01±0.066實(shí)驗(yàn)組16 32.63±11.37 0.95±0.290

表3 兩組血漿過濾前后凝血因子減少值（±s）

表3 兩組血漿過濾前后凝血因子減少值（±s）

組別 n FⅧ：C（%） Fib（g／L）對(duì)照組16 0.27±4.83 0.04±0.029實(shí)驗(yàn)組16 0.18±6.36 0.11±0.280

3 討 論

MB光化學(xué)法血漿病毒滅活技術(shù)已相當(dāng)成熟，該方法進(jìn)行血漿病毒滅活操作簡(jiǎn)便，且能滅活幾乎所有有包膜病毒［8］，但是，關(guān)于用MB光化學(xué)法病毒滅活后的血漿能否用于制備符合質(zhì)量要求的冷沉淀還尚有爭(zhēng)議［9－12］。本實(shí)驗(yàn)中將同一人份血漿均分為兩份，分別進(jìn)行加入MB與未加MB光照處理，觀察MB光化學(xué)法血漿病毒滅活對(duì)冷沉淀中較為重要且較敏感的凝血因子的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MB光化學(xué)法血漿病毒滅活對(duì)FⅧ及Fib均有較大程度上的影響。加入MB的實(shí)驗(yàn)組血漿經(jīng)病毒滅活后，F(xiàn)Ⅷ：C平均損失率達(dá)40.5%，F(xiàn)ib平均損失率達(dá)47.6%，與未加入MB的對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)由三組數(shù)據(jù)對(duì)比可看出，病毒滅活過程中FⅧ：C及Fib的損耗主要來源于MB光化學(xué)反應(yīng)，而單純光照處理影響不大，且實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組過濾前后FⅧ：C及Fib濃度的損失率相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)中，考慮到冷沉淀制備過程中人為因素影響較大，如冷沉淀中血漿保留量的影響等，未直接跟蹤檢測(cè)在制備為冷沉淀以后凝血因子的水平，而是留取檢測(cè)標(biāo)本后均按照冷沉淀原料血漿保存過程處理：三組小辮子標(biāo)本留取后立即放于－50℃冰箱速凍，待3 d以后于37℃水浴箱中復(fù)溶待檢，故本實(shí)驗(yàn)可以對(duì)制備成冷沉淀后質(zhì)量進(jìn)行預(yù)測(cè)。由于通過常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)操作制備冷沉淀時(shí)，凝血因子也還會(huì)有一定的損失，故由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出病毒滅活血漿制備為冷沉淀后凝血因子活性不符合質(zhì)量要求標(biāo)準(zhǔn)。因此，在血液成分制備中，可考慮先將新鮮冰凍血漿制備成冷沉淀后再將血漿進(jìn)行病毒滅活。

目前輸血安全性已獲得顯著提高，總體上血液已非常安全，但是由于病毒窗口期以及檢測(cè)試劑靈敏度等問題，仍然存在輸血傳播艾滋病和肝炎等傳染病的危險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道美國(guó)90%以上輸血傳播HIV和HBV以及75%以上輸血傳播HCV的危險(xiǎn)均來自窗口期感染獻(xiàn)血［13］。我國(guó)血站主要采用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）方法對(duì)血液中HBV，HCV及HIV等進(jìn)行檢測(cè)，該法試劑靈敏度差異較大且窗口期較長(zhǎng)［14］，而據(jù)報(bào)道即便是用靈敏度較高的核酸檢測(cè)也只能將HIV檢測(cè)窗口期由22d縮短到12d，HCV檢測(cè)窗口期由70d縮短到14d［15］。另外尚有很多未被認(rèn)識(shí)或一時(shí)難以找到有效檢測(cè)手段的病毒存在經(jīng)輸血傳播給受血者的危險(xiǎn)。因此，對(duì)血液成分進(jìn)行病毒滅活處理，是從根本上控制或杜絕經(jīng)輸血途徑傳播疾病的重要措施。現(xiàn)在都提倡成分輸血，對(duì)于所有血液成分中病毒含量最高、輸注危險(xiǎn)性最大的冷沉淀，則更應(yīng)進(jìn)行病毒滅活處理后用于臨床。但是我國(guó)目前推廣使用的MB光化學(xué)法血漿病毒滅活對(duì)血漿中一些有效成分，尤其是凝血因子影響較大，病毒滅活后血漿不適合用于制備冷沉淀，因此，還有待努力尋找一種更安全可靠的病毒滅活技術(shù)，以更大限度地提高輸血安全性。

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