侯佩莉，楊宏軍，王洪梅，劉文浩，何洪彬

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心，山東濟南250100）

牛流行熱又稱三日熱，是由牛流行熱病毒（Bovine ephemeral fever virus，BEFV）引起的奶牛、黃牛、水牛的急性熱性傳染病，以3歲～5歲壯年牛最易感。臨床表現(xiàn)為突然發(fā)熱、呼吸急促、消化道機能障礙、全身虛弱、役用牛跛行和肢體僵直，可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量降低，乳品質(zhì)下降，部分懷孕母牛流產(chǎn)等［1－3］。該病是一種周期性、短暫性的非接觸性傳染病，是由蚊、庫蠓等帶毒的吸血昆蟲乘風(fēng)傳播而成為感染源［4－5］。該病流行與氣候因素有相關(guān)性，多發(fā)生于高溫多雨的月份，傳播迅速，流行面廣，一般3年～5年流行一次。中國臺灣曾于1967、1983、1989、1996、1999、2001、2002、2004年發(fā)生過8次牛流行熱大流行，而且疫情暴發(fā)間隔漸漸縮短，每次疫情發(fā)病期也逐漸延長，臨床表現(xiàn)也較過去嚴(yán)重，對奶牛場和肉牛場的經(jīng)濟效益產(chǎn)生巨大的影響［6－8］。中國大陸在1949年前就有本病在部分地區(qū)發(fā)生流行的記載，隨后在25個省市均多次暴發(fā)流行，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

BEFV屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）流行熱病毒屬（Ephemerovirus），目前只有一種血清型。該病毒核酸是一條單股負(fù)鏈、不分節(jié)段RNA，基因組大小為14 900 bp，共編碼5個結(jié)構(gòu)蛋白和6個非結(jié)構(gòu)蛋白［9］。其中囊膜糖蛋白G是最主要的免疫原性蛋白，能夠誘導(dǎo)牛體產(chǎn)生有效的中和抗體，使牛抵抗強毒的攻擊，因此該病的一些診斷及治療方法是基于G基因而建立的，如ELISA、RNAi技術(shù)等［10］，G 蛋白基因也常用于制備基因工程疫苗［11］。本研究采用RT－PCR的方法從病料中對山東流行株G基因編碼區(qū)進行了克隆及測序，最大限度地保證了獲得序列的真實性及完整性，將本流行毒株G基因編碼區(qū)與國內(nèi)外參考毒株G基因編碼區(qū)進行序列比較和遺傳進化分析，初步闡明該流行毒株的基本分子生物學(xué)特點以及在系統(tǒng)發(fā)生樹中所處的位置，為分子流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 從山東某奶牛場臨床表現(xiàn)有急性發(fā)熱、呼吸道和消化道機能障礙等癥狀的疑似牛流行熱病例中，選4頭高熱期病牛，分別采其血液樣本。

1.1.2 菌種與載體 E.coli DH 5α由山東省農(nóng)科院奶牛研究中心實驗室保存；p EASY－T3 vector購自北京全式金生物技術(shù)公司。

1.1.3 主要試劑 Mini BEST Viral RNA／DNA Extraction Kit，Ta KaRa pime ScriptTMRT－PCR Kit，LA Taq酶，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 BEFV G基因的擴增 根據(jù)GenBank上發(fā)表的牛流行熱病毒G基因編碼區(qū)設(shè)計一對引物，由上海生物工程有限公司合成。上游引物：ATG TTC AAG GTC CTC ATA ATT AC；下游引物：TTA ATG ATC AAA GAA CCT ATC ATC AC。

取200μL臨床高熱期血液樣本作為病毒RNA提取樣品，按 MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit說明書進行操作。按照 Ta KaRa pime－ScriptTMRT－PCR Kit說明書進行 RT－PCR反應(yīng)。

1.2.2 病毒G基因的克隆與鑒定 以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，以合成的G編碼區(qū)特異性引物擴增G基因編碼區(qū)。PCR反應(yīng)體系為：LA Taq 1μL，10×buffer 5μL，上游引物1μL（20μmol），下游引物1μL（20μmol），DNA 模板4μL，d NTP6μL（2.5 mmol／L），無菌雙蒸水32μL，總體積為50μL。反應(yīng)條件為：94℃4 min；94℃30 s，52℃50 s，72℃2 min，31個循環(huán)；72℃10 min。PCR結(jié)束后，擴增的特異性片段經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳分離，用 AXYGEN Gel Extraction Kit回收純化后，將擴增的片段與pEASY－T3載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布LB／Amp＋／IPTG／X－gal平板，藍(lán)白斑篩選后提取重組質(zhì)粒DNA。經(jīng)PCR、NotⅠ／Eco RⅠ雙酶切鑒定，挑菌落PCR鑒定，得到含目的片段的陽性重組質(zhì)粒用于測序分析。

1.2.3 基因序列測定和分析 將陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測定結(jié)果與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中登錄的牛流行熱病毒基因進行同源性分析，用DNA Star軟件獲得片段對核苷酸和氨基酸序列的同源性進行比較。用Clustal X 1.8和 MEGA 4.0等軟件進行進化樹分析。

2 結(jié)果

2.1 牛流行熱病毒G基因的擴增、克隆與鑒定

從采集樣本的抗凝血中分別提取病毒RNA，經(jīng)RT－PCR，用特異性引物進行擴增，經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，不同發(fā)病牛血液樣本病毒cDNA經(jīng)特異引物擴增均可獲得預(yù)期1 872 bp大小的片段（圖1）。將PCR產(chǎn)物送測序公司進行序列測定分析表明，不同發(fā)病牛血液樣本擴增獲得的片段相同。為了獲得完整的BEFV的G基因核苷酸序列，將PCR產(chǎn)物連接p EASY－T3，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)NocⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，可見目的條帶（圖2）。經(jīng)過序列測定分析，獲得BEFV的G基因核苷酸序列，該片段的核苷酸序列和氨基酸序列與BEFV的同源性與中國臺灣株1996／TW／TN1 glycoprotein G的相似度為97%。

2.2 牛流行熱病毒G基因序列測定及分析

G蛋白基因編碼區(qū)全長約1 872 bp，該基因編碼含623個氨基酸、分子質(zhì)量為81 ku的糖蛋白。應(yīng)用DNAStar6.0生物軟件對預(yù)測的G氨基酸序列進行分析（圖3），結(jié)果柔韌性區(qū)分布相對較均勻，提示該蛋白肽段柔韌性較大，形成抗原表位的可能性較大，容易與抗體進行嵌合。在該基因N端是典型的真核膜蛋白信號肽序列區(qū)，包括N末端負(fù)電荷區(qū)和與肽酶切位點相近的多極化區(qū)域。

2.3 流行毒株G基因同源性比較和進化樹分析

將擴增的G蛋白基因命名為2011－Shandong，利用DNA Star對其與GenBank中公布的部分流行毒株的核苷酸及推導(dǎo)氨基酸進行同源性比較，結(jié)果表明，核苷酸序列同源性為97.8%～99.8%，氨基酸的同源性為96.3%～100%，具有較高的保守性。

應(yīng)用 MEGA5.1軟件（Neighbor－joining）方法，根據(jù)流行毒株G基因的核苷酸序列和GenBank中登錄的歐美、亞洲主要流行毒株G基因的核苷酸序列繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖4）。進化樹顯示2011／Shandong流行株G基因與中國臺灣流行株的親緣關(guān)系較近。

圖3 BEFV山東流行株G基因分析Fig.3 The G gene sequence analysis of BEFV in Shandong

3 討論

牛流行熱是一種由節(jié)肢動物為媒介所引起的病毒性疾病，本病傳播迅速，流行面廣，發(fā)病率高。牛流行熱疫情仍在世界各地持續(xù)暴發(fā)，間歇期漸漸縮短，每次疫情的發(fā)病期逐漸延長，臨床癥狀也較過去嚴(yán)重，其危害越來越大［12］。然而，對牛流熱及其病原的基礎(chǔ)性研究不夠深入，尚未建立起可用于生產(chǎn)實踐的標(biāo)準(zhǔn)化診斷技術(shù)，無法做到牛流行熱的早期發(fā)現(xiàn)、實時監(jiān)測及其流行病學(xué)調(diào)查等。BEFV宿主范圍不斷趨于擴大，臨床上也在山羊、綿羊及鹿檢測到本病的抗體，并且在鹿有類似牛流行熱的臨床病例。在抗體檢測方面，非洲也曾在水牛、大羚羊、非洲羚羊及南非大羚羊檢測出本病毒的抗體［13］。

牛流行熱病毒山東流行株G基因序列分析結(jié)果表明，G蛋白保守性很高，通過比較BEFV山東流行株G基因和NCBI／GenBank中的其他數(shù)據(jù)，核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列的同源性大于90%。將山東流行毒株G基因編碼區(qū)與國內(nèi)外參考毒株G基因編碼區(qū)進行序列比較和遺傳進化分析，表明山東流行株BEFV與中國臺灣流行株具有較高同源性和較近的親緣關(guān)系，初步闡明了該毒株的基本分子生物學(xué)特點以及在系統(tǒng)發(fā)生樹中所處的位置。

用單克隆抗體技術(shù)分析，G蛋白表面存在5個抗原位點（G1、G2、G3a、G3b、G4），其中G1和G4為非構(gòu)象化位點，G1為BEFV所特有，只與牛流行熱陽性血清發(fā)生反應(yīng)，可以特異性檢測血清抗體，而其他位點與同科的相關(guān)病毒則存在交叉反應(yīng)［14］。與Gen Bank中具有代表性的BEFV G蛋白進行相似性比較，結(jié)果顯示，山東流行株BEFV G蛋白的氨基酸突變主要集中在G1區(qū)域，共有11處突變，分別為第400位 V－I、420位 G－R、436位 N－T、437位R－K、460位 L－I、466位 D－E、477E－D、481位 V－I、487位R－K、499位 N－S、518位 K－R，這些突變很可能會影響G1蛋白的生物學(xué)功能，尤其是否影響血清型的變化，有待進一步的研究。對G基因的分析，為探討B(tài)EFV的G基因功能、研究BEFV的致病機理、血清型分型、分子變異發(fā)生機制以及研發(fā)新型安全有效的基因疫苗等奠定了基礎(chǔ)。

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