吳紅松

（菏澤學(xué)院，山東菏澤274015）

三聚氰胺（C3N5H6）是重要的有機(jī)化工中間產(chǎn)品，但由于其含氮量很高（66%），近年來作為一種提高飼料或食品中蛋白質(zhì)檢測(cè)指標(biāo)的所謂“蛋白精”非法加入飼料或食品中采取暴利，產(chǎn)生了非常惡劣的影響。2007年，發(fā)生在美國的三聚氰胺混合于食物原料中所引起的寵物中毒事件，使這一化合物引起了廣泛關(guān)注；2008年發(fā)生在中國的三聚氰胺奶粉事件，更使這個(gè)化合物成為食品公共安全的焦點(diǎn)。

黃河鯉魚隸屬于鯉形目、鯉科、鯉亞科、鯉屬，國內(nèi)年產(chǎn)量已達(dá)200多萬噸，占淡水養(yǎng)殖總量的15%左右，在淡水養(yǎng)殖品種中列第4位。由于蛋白原料在水產(chǎn)飼料中所占的比例要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他動(dòng)物飼料，因此，三聚氰胺對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的影響更是不容忽視。有關(guān)三聚氰胺在哺乳動(dòng)物中的毒性作用已有研究［1－6］，但對(duì)魚類的毒性研究目前僅限于急性毒性試驗(yàn)報(bào)道或魚組織中三聚氰胺及其類似物的檢測(cè)方法［7－9］，而關(guān)于三聚氰胺對(duì)魚類各組織結(jié)構(gòu)的損傷程度如何還未見報(bào)道。

因此，本文以黃河鯉魚為試驗(yàn)用動(dòng)物，通過注射染毒，研究三聚氰胺對(duì)鯉魚各器官中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量的影響，以期為三聚氰胺在水產(chǎn)飼料中的安全性評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 鯉魚，購于菏澤東明黃河養(yǎng)殖場(chǎng)。體重46.25 g±7.81 g，體長18.15 cm±4.50 cm。在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周后，選取活潑、無病、體表無損傷的個(gè)體進(jìn)行染毒試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 三聚氰胺為北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；鄰苯三酚為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；Tris為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；EDTA為上海試劑一廠產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 冰凍離心機(jī)，Gl－20G－723分光光度計(jì)，恒溫箱，電子天平，玻璃勻漿器，水浴鍋等。

1.2 方法

1.2.1 染毒方法 本試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理組，1個(gè)對(duì)照組，每組10條鯉魚，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。依據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果（預(yù)先對(duì)相同規(guī)格的鯉魚進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)），設(shè)置三聚氰胺腹腔注射濃度為1、10、100、1 000、2 000 mg／L，劑量為1 mL／100 g。試驗(yàn)在50 L塑料水箱中進(jìn)行，每箱內(nèi)裝30 L水，水溫為15℃±1℃。

1.2.2 酶液的提取 處理48 h后，從各處理組隨機(jī)各取鯉魚3條，放在冰盤內(nèi)迅速解剖，取出鯉魚的腦、肝、腎、鰓，用預(yù)冷的6.5 g／L的生理鹽水沖洗干凈表面血跡，吸水紙吸干水分，電子天平上稱重，并以 W（g）∶V（mL）＝1∶4的比例加入預(yù)冷的6.5 g／L生理鹽水，玻璃勻漿器勻漿，離心（4℃，2 000 r／min，20 min），取上清液，置于4℃冰箱備用，24 h內(nèi)測(cè)量完成。

1.2.3 酶活性測(cè)定 SOD酶活性的測(cè)定采用鄰苯三酚法［11］，活力單位定義為每毫克蛋白，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量為1個(gè)活力單位。POD酶活性的測(cè)定參考張貴生［12］的方法，活力單位定義為每分鐘OD 470nm變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活力單位。MDA測(cè)定采用硫代巴比妥酸在532 nm處進(jìn)行比色測(cè)定［13］。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)處理 利用SPSS軟件，求出平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），各試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法（LSD），取顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的三聚氰胺對(duì)鯉魚腦、肝、腎、腮中超氧化物岐化酶（SOD）活性的影響

由表1可見，在三聚氰胺作用下，鯉魚腦、肝、腎、腮中SOD活性先表現(xiàn)為上升，且存在一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系，在10 mg／L濃度時(shí)各組織中SOD活性達(dá)到最高，除肝外均表現(xiàn)為顯著誘導(dǎo)（P＜0.05），此后酶活性開始下降，即在100、1 000、2 000 mg／L高濃度處理組，均表現(xiàn)為抑制，其中在肝、腎、腮中為顯著抑制（P＜0.05）。說明在三聚氰胺對(duì)各組織SOD活性表現(xiàn)出了組織差異性，對(duì)腦影響不顯著，對(duì)肝、腎、腮表現(xiàn)出強(qiáng)烈抑制作用。

2.2 不同濃度的三聚氰胺對(duì)鯉魚腦、肝、腎、腮中過氧化氫酶（POD）活性的影響

由表2可見，在三聚氰胺作用下，鯉魚腦、肝、腎、腮中POD活性先表現(xiàn)為上升，且存在一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系，在10 mg／L濃度時(shí)肝、腎、腮中POD活性達(dá)到最高，而腦中POD活性在100 mg／L濃度下達(dá)到最高，但均表現(xiàn)為極顯著誘導(dǎo)（P＜0.01），此后酶活性開始下降，在1 000 mg／L、2 000 mg／L高濃度處理下，均表現(xiàn)為抑制，但均比對(duì)照組高。說明在注射濃度范圍內(nèi)，三聚氰胺對(duì)各組織中POD活性，均表現(xiàn)為低促高抑的特點(diǎn)，但誘導(dǎo)作用尤為明顯。

2.3 不同濃度的三聚氰胺對(duì)鯉魚腦、肝、腎、腮中丙二醛（MDA）含量的影響

表3顯示，隨著三聚氰胺濃度的升高，腦、肝、腎、腮中MDA含量存在一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系，與對(duì)照組相比，在1 mg／L處理濃度下，腎中MDA含量差異較腦、肝、腮中顯著，在10 mg／L處理濃度下，各組織中 MDA含量差異顯著（P＜0.05），在100、1 000、2 000 mg／L高濃度下，各組織中 MDA含量差異極顯著（P＜0.01），說明試驗(yàn)注射三聚氰胺的劑量能明顯地引起各組織細(xì)胞氧化損傷，破壞細(xì)胞膜的通透性和完整性。且表現(xiàn)出了組織差異性，對(duì)腦、肝、腮的損傷不如對(duì)腎的明顯。

表1 三聚氰胺對(duì)鯉魚不同組織中SOD活性的影響Table1 Effect of melamine on SOD activities in different tissues of C.carpio U／mg

表2 三聚氰胺對(duì)鯉魚不同組織中POD活性的影響Table2 Effect of melamine on POD activities in different tissues of C.carpio U／mg

表3 三聚氰胺對(duì)鯉魚不同組織中MDA含量的影響Table3 Effect of melamine on MDA content in different tissues of C.carpio μmol／mg

3 討論

有機(jī)體由于新陳代謝和各種生物化學(xué)反應(yīng)，不斷產(chǎn)生自由基，如超氧陰離子（O2－·）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（OH－·）等，這些自由基可引起細(xì)胞成分發(fā)生化學(xué)變化和損害，而機(jī)體通過動(dòng)員其抗氧化系統(tǒng)以對(duì)抗自由基的毒性作用。一旦外界因素引起自由基損傷系統(tǒng)和防御系統(tǒng)平衡失調(diào)時(shí)，產(chǎn)生的自由基不能及時(shí)被清除，則會(huì)引起細(xì)胞的損傷。

魚體中SOD是一類金屬酶含Cu、Zn原子，能催化超氧陰離子自由基（O2－·）轉(zhuǎn)化為過氧化物，POD等酶類又進(jìn)一步催化組織中低濃度的過氧化物氧化其他底物，清除過氧化物和H2O2，從而降低自由基對(duì)機(jī)體的損害作用。本試驗(yàn)表明，在腹腔注射1 mg／L、10 mg／L三聚氰胺時(shí)，各組織SOD活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明少量三聚氰胺誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫興奮效應(yīng)，激活相關(guān)酶類活性，導(dǎo)致有氧代謝旺盛，產(chǎn)生較多的自由基，自由基刺激SOD的mRNA高水平表達(dá)，提高了SOD活性；注射濃度為2 000 mg／L時(shí)，各組織SOD顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），表明大量的三聚氰胺誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自由基的量超過了機(jī)體的代償能力，導(dǎo)致抗氧化酶出現(xiàn)消耗性降低，過量的自由基攻擊細(xì)胞，破壞了SOD防御系統(tǒng)，SOD活性降低。

在注射濃度為1 mg／L、10 mg／L時(shí)，各組織中POD活性極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），表明少量三聚氰胺引起機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，刺激細(xì)胞合成大量POD酶，提高POD酶活性；注射濃度為1 000 mg／L、2 000 mg／L時(shí)，各組織中 POD 活性逐步降低，表明隨著機(jī)體攝入三聚氰胺量的增加，機(jī)體在短時(shí)間產(chǎn)生的過量過氧化物無法及時(shí)被清除，長時(shí)間攻擊細(xì)胞，破壞了抗氧化系統(tǒng)，抑制了POD酶的合成，導(dǎo)致POD酶活性降低。

丙二醛（MDA）是過氧化脂質(zhì)的降解產(chǎn)物，能使蛋白質(zhì)和核酸受損，導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷。其含量的高低反映機(jī)體細(xì)胞遭受自由基攻擊的程度。本試驗(yàn)表明，在三聚氰胺作用下，各組織中MDA含量高于對(duì)照組，表明機(jī)體攝入大量三聚氰胺后破壞了機(jī)體抗氧化酶機(jī)制，抗氧化酶活性下降，過量的自由基無法被清除，導(dǎo)致大量脂質(zhì)過氧化物降解，MDA含量增加。

綜上所述，三聚氰胺對(duì)鯉魚腦、肝、腎、腮中SOD、POD活性及MDA含量的改變，可能間接反映了各組織結(jié)構(gòu)的損傷程度，但其代謝及殘留情況如何等還有待進(jìn)一步研究。

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