周 川，趙云程，黃俊成＊

（1.新疆動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

細(xì)胞融合技術(shù)在研究哺乳動(dòng)物配子發(fā)生、發(fā)育、核質(zhì)關(guān)系、四倍體的發(fā)生、遺傳、免疫機(jī)制等方面有重要的價(jià)值［1］，也有助于獲得全部來自胚胎干細(xì)胞和多功能誘導(dǎo)干細(xì)胞的小鼠［2－3］。制作四倍體胚胎具有3種方法，即藥物處理，使DNA加倍；采用顯微注射技術(shù)將一個(gè)二倍體胚胎的細(xì)胞核注射到另一個(gè)二倍體胚胎中；卵裂球融合法，如電融合法［4－6］、仙臺(tái)病毒法［7］、化學(xué)藥物法［1，8］等，其中電融合法最為常用。電融合的原理是在2－細(xì)胞胚胎的卵裂球結(jié)合面上施加直流電脈沖，使細(xì)胞膜造成穿孔而發(fā)生融合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠、試劑和儀器 昆明小鼠和ICR小鼠購(gòu)于新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心、甘露醇 M1902－500G、蔗糖S1888－500G、胚胎移植水 W1503、NaCl S5836、Na2HPO4S5136、KH2PO4P5655、KCl P5405、M16 M7292均為Sigma公司產(chǎn)品。電融合儀為FHK Fujihira industry 產(chǎn)品，體視鏡 SMZ645、倒置鏡TE2000－U為 Nikon產(chǎn)品、胎牛血清16000－044為GIBCO公司產(chǎn)品，撿胚和沖胚針自制，培養(yǎng)箱371為Thermo公司產(chǎn)品，PMSG為寧波市激素制品有限公司產(chǎn)品，HCG為寧波第二激素廠產(chǎn)品、35 mm培養(yǎng)皿430165為Corning公司產(chǎn)品。

1.1.2 配液 PBS：NaCl為4 g，KCl為 0.1 g，KH2PO4為0.1 g，Na2HPO4為0.572 16 g；移植液、沖胚液：PBS∶胎牛血清＝9∶1；0.3 mol／L甘露醇融合液：0.273 g甘露醇溶于5 mL胚胎移植水，0.3 mol／L蔗糖融合液：0.513 g蔗糖溶于5 mL胚胎移植水。

1.2 方法

1.2.1 供體及受體超排 新購(gòu)小鼠進(jìn)入光周期，9：00～21：00為光照期，其余時(shí)間為黑夜。雌鼠育飼至25 g左右控制食量使其體重保持在25 g左右，昆明白雌鼠做供體，ICR雌鼠做受體。供體每天19：00每只雌鼠注射5 IU PMSG，46 h～48 h每只雌鼠注射5 IU HCG，并與雄鼠合籠，受體與結(jié)扎雄鼠合籠。受體的超排和合籠均比供體晚24 h。合籠的第2天早晨查栓，見栓的供體從輸卵管沖2－細(xì)胞胚胎，見栓的受體做代孕雌鼠。雌雄小鼠均為8周齡～12周齡。

1.2.2 2 －細(xì)胞胚胎的獲取 見栓的供體在注射HCG后43 h～50 h內(nèi)頸椎脫臼處死，打開腹腔將輸卵管和卵巢一起剪下，放入盛有沖胚液的35 mm培養(yǎng)皿中，將輸卵管從卵巢上剝離。將沖胚針吸入一定量的沖胚液，針口插入輸卵管傘部沖出2－細(xì)胞胚胎，并用撿胚針收集2－細(xì)胞胚胎，過M16液滴3次后放入M16液滴，放入培養(yǎng)箱待用。

1.2.3 2 －細(xì)胞融合及觀察 收集的胚胎過3次融合液滴后置于充滿融合液的電極槽內(nèi)，并手動(dòng)撥動(dòng)胚胎使胚胎的方向與兩電極垂直［9］。融合液采用0.3 mol／L甘露醇，電融合參數(shù)為AC 120 V／mm 20 μs×2、AC 100 V／mm 40μs×2、AC 80 V／mm 80 μs×2。融合后的胚胎過M16液滴3次并放入M16液滴，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.4 移植 將發(fā)育至囊胚的四倍體胚胎移植入同期代孕雌鼠子宮。將代孕雌鼠麻醉，背部開口取出子宮的一角，用1 mL注射器針頭在子宮上打孔。用撿胚針撿取囊胚過移植液滴3次后通過子宮上的孔將囊胚移入代孕雌鼠子宮內(nèi)。將代孕雌鼠縫合，給足鼠料和水，置于溫暖處。

2 結(jié)果

每30 min在體視鏡下觀察一次融合后的胚胎（圖1A），將融合的胚胎挑出并計(jì)數(shù)，連續(xù)觀察數(shù)天，將發(fā)育至囊胚的胚胎挑出并計(jì)數(shù)（（圖1B～E）。

2.1 電融合液為0.3 mol／L蔗糖溶液的電融合及發(fā)育結(jié)果

本組試驗(yàn)采用120 V／mm，20μs×2；100 V／mm，40μs×2；80 V／mm，80μs×2三種電融合參數(shù)。在120 V／mm，20μs×2電融合參數(shù)下共處理12枚2－細(xì)胞胚胎，僅得到1枚融合胚，融合率為8.3%，此融合胚沒有繼續(xù)發(fā)育。在100 V／mm，40 μs×2電融合參數(shù)下共處理25枚2－細(xì)胞胚胎，其中13枚融合，融合率為52%，5枚卵裂，卵裂率為38.5%，僅2枚發(fā)育至囊胚，囊胚率為40%。在80 V／mm，80μs×2電融合參數(shù)下共處理22枚2－細(xì)胞胚胎，其中17枚融合，融合率為77.3%，有11枚融合胚卵裂，卵裂率為64.7%，7枚發(fā)育至囊胚，囊胚率為63.6%（表1）。

圖1 不同時(shí)期四倍體胚胎Fig.1 Tetraplont embryos in different stages

表1 融合液為0.3 mol／L蔗糖溶液Table1 The electrofusion solution is 0.3 mol／L sucrose solution

2.2 電融合液為0.3 mol／L甘露醇溶液的電融合及發(fā)育結(jié)果

本組試驗(yàn)采用120 V／mm，20μs×2；100 V／mm，40μs×2；80 V／mm，80μs×2三種電融合參數(shù)。在120 V／mm，20μs×2電融合參數(shù)下共處理26枚2－細(xì)胞胚胎，得到18枚融合胚，融合率為69.2%，得到的18枚融合胚全部卵裂，卵裂率為100%，其中2枚發(fā)育至囊胚，囊胚率為11.1%。在100 V／mm，40μs×2電融合參數(shù)下共處理24枚2－細(xì)胞胚胎，其中23枚融合，融合率為95.8%，19枚卵裂，卵裂率為82.6%，12枚發(fā)育至囊胚，囊胚率為63.2%。在80 V／mm，80μs×2電融合參數(shù)下共處理320枚2－細(xì)胞胚胎，其中296枚融合，融合率為92.5%，有288枚融合胚卵裂，卵裂率為97.3%，261枚發(fā)育至囊胚，囊胚率為90.6%（表2）。

2.3 四倍體囊胚在體內(nèi)發(fā)育

共為4只代孕雌鼠移植55枚四倍體胚胎，超過預(yù)產(chǎn)期均未產(chǎn)下幼仔。斷頸處死4只代孕母鼠解剖后僅得到1只死亡的畸形胎兒。

表2 融合液為0.3 mol／L甘露醇溶液Table2 The electrofusion solution is 0.3 mol／L mannitol solution

3 討論

在三種電融合參數(shù)下，采用甘露醇溶液做融合液所獲得的融合率、卵裂率、囊胚率均高于相同電融合參數(shù)下采用蔗糖溶液做融合液所獲得的融合率、卵裂率、囊胚率，說明甘露醇溶液能在電融合過程中更好地保護(hù)胚胎。

采用相同的融合液，在不同的電融合參數(shù)下融合率、卵裂率、囊胚率都有所不同。在兩種融合液下，隨著脈沖電壓的降低和脈沖寬度的提升，融合率、卵裂率、囊胚率都顯著提升，即在較高脈沖電壓下（120 V／mm），即使脈沖寬度很短（20μs）也不會(huì)獲得很好的融合率和發(fā)育率，而在較低脈沖電壓下（80 V／mm），即使延長(zhǎng)脈沖寬度（80μs）也能獲得高的融合率和發(fā)育率。

電壓強(qiáng)度是影響融合率的重要因素［10］。在電融合過程中，2－細(xì)胞胚胎的兩個(gè)卵裂球之間的細(xì)胞膜在電場(chǎng)作用下破裂并相互融合［11］，電壓過高會(huì)造成胚胎的死亡［12］，而電壓過低則不能使細(xì)胞膜破裂，2－細(xì)胞胚胎不能融合。

小鼠四倍體胚胎在囊胚之前的發(fā)育速度與二倍體胚胎相似，但所包含的細(xì)胞數(shù)量少于二倍體胚胎［13］，在之后的發(fā)育中，四倍體胚胎發(fā)育的速度要慢于二倍體胚胎的發(fā)育速度。Lu T等［14］將小鼠四倍體胚胎與二倍體胚胎嵌合，嵌合體幼仔具備四倍體細(xì)胞，但在發(fā)育過程中四倍體細(xì)胞逐漸消失，其原因可能是四倍體細(xì)胞的細(xì)胞周期比二倍體細(xì)胞的細(xì)胞周期要長(zhǎng)，分裂速度比二倍體細(xì)胞慢，在發(fā)育過程中逐漸被二倍體細(xì)胞替代。四倍體胚胎在發(fā)育過程中逐漸死亡，其原因可能是其分裂速度慢，沒有足夠數(shù)量的細(xì)胞支持發(fā)育的整個(gè)過程。Kato Y等［15］將兩個(gè)小鼠四倍體胚胎整合，使四倍體胚胎的數(shù)目達(dá)到二倍體胚胎的水平，但四倍體胚胎仍不能完全發(fā)育，推測(cè)其失敗原始可能是四倍體細(xì)胞有較長(zhǎng)的細(xì)胞周期。

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