任清丹，楊樹寶，于玉芬，文學(xué)忠，袁 陸，楊麗華，欒維民＊

（1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春130062；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)展學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130600）

盲腸扁桃體（caecal tonsil，CT ）是禽類消化道中最大免疫組織，位于回－盲－直腸連接部，較為發(fā)達(dá)，肉眼可看見略有膨大，CT固有層和黏膜下層中富含彌散性的淋巴集結(jié)，其內(nèi)有小淋巴細(xì)胞、成熟和未成熟的漿細(xì)胞［1］。淋巴集結(jié)內(nèi)含有較大的生發(fā)中心，是合成抗體非常重要的場(chǎng)所，對(duì)腸內(nèi)細(xì)菌還有其他抗原物質(zhì)起到局部免疫應(yīng)答作用。CT內(nèi)的淋巴細(xì)胞包括45%～53%的B淋巴細(xì)胞，大約34%的T淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞既參與抗體的產(chǎn)生，也參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能［2］。研究雞盲腸扁桃體發(fā)育及其免疫功能的發(fā)生，從而了解雞出殼后生長(zhǎng)初期的免疫狀態(tài)，為禽類的適時(shí)免疫和疾病防治提供理論基礎(chǔ)，對(duì)免疫學(xué)的發(fā)展具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義［3］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Image－proexpress 5.1圖像分析軟件（美國 Media Cybernetics公司）；依愛 EIF／C.DME 3456孵化機(jī)／出雛機(jī)，Leica CM 1850冰凍切片機(jī)，Olympus CX41顯微鏡，Pixera pro 150ES圖像采集器。

1.1.2 試劑 冰凍切片用OCT組織包埋液（美國Sakura）APES，DAB顯色液，丙酮，酒精，二甲苯為北京化工廠產(chǎn)品；蘇木精，伊紅為中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 海蘭白雞，其種蛋為長(zhǎng)春凈月潭開發(fā)區(qū)銀河養(yǎng)殖場(chǎng)孵化雛雞。

1.1.4 免疫原 牛血清白蛋白（BSA）為北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物免疫接種 新生小雞飼養(yǎng)于用甲醛－高錳酸鉀熏蒸消毒的動(dòng)物房中，將雛雞分為免疫組和對(duì)照組，每組50只，對(duì)免疫組雛雞進(jìn)行定時(shí)空腹口服免疫，每只雞口服1 mL濃度為10 mg／mL BSA，連續(xù)口服免疫6 d。在最后一次免疫后的1、4、7、10、13、16、19、22、25、28 d分別隨機(jī)選取4只雞，取其盲腸扁桃體。對(duì)照組也在各免疫組取材相同的日齡時(shí)取相同部位的組織，用OCT組織包埋液包埋，放在－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 冰凍切片 將放在－80℃冰箱備用的雞的盲腸扁桃體組織取出，用冰凍切片機(jī)，制成厚度為5 μm的組織切片，以進(jìn)行HE染色。

1.2.3 HE染色方法 向粘貼于載玻片上的盲腸扁桃體組織滴加5 g／L火棉膠2滴，自然干燥約2 min后，100 mL／L甲醛固定30 s；蒸餾水洗2次，每次2 min；蘇木素染色10 min；自來水藍(lán)化；10 mL／L鹽酸酒精分化30 s；自來水返藍(lán)；伊紅復(fù)染1 min；850 mL／L酒精10 s；950 mL／L酒精10 s；乙醚－酒精1 min，脫去火棉膠；酒精固定2次，每次30 s；二甲苯固定2次，每次30 s；封固后照相。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 HE染色照相后，采用Imagepro express 5.1圖像分析軟件對(duì)每張盲腸扁桃體HE染色照片里的腸絨毛長(zhǎng)度、皺褶高度和腸腺深度和生發(fā)中心直徑進(jìn)行測(cè)定，每張切片測(cè)5個(gè)視野，而后求平均值，所得數(shù)據(jù)用（ˉX±SD）表示，對(duì)不同日齡的雞盲腸扁桃體的腸絨毛長(zhǎng)度、皺褶高度和腸腺深度和生發(fā)中心直徑進(jìn)行差異的顯著性檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用Spss13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 7日齡時(shí)雞盲腸扁桃體組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育

免疫組和對(duì)照組雞7日齡時(shí)，腸絨毛增長(zhǎng)并逐漸變粗，細(xì)胞排列較緊密，腸腺較為明顯。黏膜結(jié)構(gòu)也發(fā)生了較大的變化，腸絨毛的固有層明顯增厚且變寬，絨毛互相融合在一起形成大的黏膜皺襞，免疫組比對(duì)照組皺襞明顯增加，差異顯著（P＜0.05）（圖1～圖2）。

圖1 免疫組7日齡（HE×100）（箭頭：黏膜皺襞）Fig.1 7－day－old immune group（HE×100）（arrow：mucosal folds）

2.2 16日齡時(shí)雞盲腸扁桃體組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育

免疫組和對(duì)照組16日齡時(shí)雞的盲腸扁桃體中均能觀察到有網(wǎng)狀細(xì)胞包裹的形態(tài)完整的生發(fā)中心，免疫組生發(fā)中心數(shù)量和直徑明顯大于對(duì)照組生發(fā)中心數(shù)量和直徑，差異顯著（P＜0.05）（圖3～圖4），生發(fā)中心大多數(shù)分布在黏膜層的中下部區(qū)域，多為卵圓形，四周包圍結(jié)締組織形成的被膜，免疫組生發(fā)中心與周圍組織界限清楚，常單獨(dú)存在，少數(shù)可見聚集成群，著色較深。對(duì)照組生發(fā)中心明顯較小，邊緣不整齊與周圍組織的界限不清，淋巴濾泡形成較少，著色暗淡，隨著雞日齡的增長(zhǎng)，免疫組和對(duì)照組的雞盲腸扁桃體中生發(fā)中心的數(shù)量逐漸增多，直徑明顯增大，腸腺深度和皺襞高度也都明顯增大（表1）。

圖2 對(duì)照組7日齡（HE×100）（箭頭：黏膜皺襞）Fig.2 7－day－old control group（HE×100）（arrow：mucosal folds）

圖3 免疫組16日齡（HE×100）（箭頭：生發(fā)中心）Fig.3 16－day－old immune group（HE×100）（arrow：germinal center）

圖4 對(duì)照組16日齡（HE×100）（箭頭：生發(fā)中心）Fig.4 16－day－old control group（HE×100）（arrow：germinal center）

表1 不同日齡雞盲腸扁桃體（免疫組和對(duì)照組）組織結(jié)構(gòu)變化情況Table1 The histological changes in caecal tonsil of different old－age chickens（control group and immune group）

3 討論

研究顯示，免疫組盲腸扁桃體中的生發(fā)中心數(shù)量比對(duì)照組盲腸扁桃體中生發(fā)中心數(shù)量多，而且生發(fā)中心直徑比對(duì)照組生發(fā)中心直徑長(zhǎng)。免疫組腸腺深度和黏膜皺褶厚度都比對(duì)照組腸腺深度和黏膜皺褶厚度都有明顯增加，并且在22日齡～28日齡時(shí)，免疫組與對(duì)照組相比差異顯著（p＜0.05），出現(xiàn)這種情況的原因可能是因?yàn)榭诜庖逿細(xì)胞依賴性抗原后刺激盲腸扁桃體內(nèi)各個(gè)組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生了較大變化，增強(qiáng)了雞的免疫功能。對(duì)照組中，隨著雞日齡的增加，盲腸扁桃體中的生發(fā)中心數(shù)量不斷增加，盲腸扁桃體特征結(jié)構(gòu)也在不斷發(fā)育，并在25日齡后達(dá)到成熟狀態(tài)，這與張立世等［4］研究結(jié)果不一致，他們認(rèn)為雞在21日齡時(shí)組織結(jié)構(gòu)就基本達(dá)到成熟水平，我們的結(jié)果是在25日齡時(shí)盲腸扁桃體組織結(jié)構(gòu)達(dá)到成熟水平。而Jeurissen S H 等［5］用組織學(xué)方法在14日齡時(shí)未發(fā)現(xiàn)生發(fā)中心的存在，這一結(jié)果與本研究相同，我們用HE染色觀察14日齡時(shí)雞的盲腸扁桃體，也未發(fā)現(xiàn)生發(fā)中心的出現(xiàn)，但在16日齡時(shí)觀察到盲腸扁桃體中有由B淋巴細(xì)胞聚集的生發(fā)中心。到19日齡后觀察到輪廓更為清晰的生發(fā)中心，這一結(jié)果與Gomez D M 等［6］報(bào)道的4日齡時(shí)雞盲腸扁桃體中出現(xiàn)生發(fā)中心，以及Hoshi H等［7］報(bào)道的14日齡時(shí)盲腸扁桃體中出現(xiàn)生發(fā)中心的結(jié)果存在差異。這可能是由于試驗(yàn)條件和試驗(yàn)動(dòng)物的差異所造成的。在外周淋巴組織中，生發(fā)中心是由抗原刺激產(chǎn)生的，因此雞盲腸扁桃體中生發(fā)中心出現(xiàn)的時(shí)間及數(shù)量，很大程度上受到腸道中正常菌群出現(xiàn)的時(shí)間、數(shù)量以及有無感染等因素的影響，此外，雞的品種、免疫方法和免疫程序、飼養(yǎng)條件等也都可以成為影響生發(fā)中心出現(xiàn)時(shí)間和數(shù)量的重要影響因素。

［1］鮑恩東，陳萬芳.雞胚免疫系統(tǒng)器官組織學(xué)變化觀察［J］.中國獸醫(yī)科技，1996，2（26）：26－27.

［2］余銳萍，陳 越.日糧鋅粞水平對(duì)肉雞盲腸扁桃體結(jié)構(gòu)的影響［J］.中國獸醫(yī)雜志，2004，40（7）：10－12.

［3］朱國強(qiáng)，王永坤.禽免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能［J］.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2001，3（1）：27－30.

［4］張立世，楊樹寶，姜云壘，等.雞盲腸扁桃體組織結(jié)構(gòu)早期發(fā)育的動(dòng)態(tài)觀察［J］.家禽科學(xué)，2011，4（23）：1673－1085.

［5］Jeurissen S H，Janse E M，Koch G，et al.Postnatal development of mucosa－associated lymphoid tissues in chickens ［J］.Cell Tissue Res，1989，258 （1）：119－124.

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［7］Hoshi H，Mori T.Identification of the bursa－dependent and thymus－dependent areas in the tonsilla caecalis of chickens［J］.Tohoku J Exp Med，1973，111（4）：309－322.