王云龍，王 娟，李玉林，董彩文，孫新城，張怡青，王國(guó)強(qiáng)，李恒思，劉旺根

（1.河南師范大學(xué)，河南新鄉(xiāng)453007；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450001；3.河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450001）

丁型肝炎病毒（Hepatitis delta virus，HDV）感染呈全球分布，尤其是與乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）共感染或聯(lián)合感染，會(huì)迅速暴發(fā)并可能發(fā)展成肝癌或肝硬化［1］。目前，對(duì)于丁型肝炎的治療還沒特效藥物和有效的治療手段［2］，早期診斷和預(yù)防是防止病毒感染的主要措施。早期診斷主要是檢測(cè)血清中Ig M抗體，獲得特異性抗原是建立檢測(cè)方法的主要難題。

丁型肝炎病毒基因組全長(zhǎng)1.7 kb，含有多個(gè)開放閱讀框，其中一個(gè)開放閱讀框（ORF5）表達(dá)蛋白與HDAg功能性有關(guān)［3－4］。目前 HDAg在原核、真核細(xì)胞和昆蟲病毒中均有表達(dá)［5－7］。本研究擴(kuò)增 HDAg表達(dá)基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和純化，獲得了純度較高的蛋白，可為建立丁型肝炎早期檢測(cè)試劑盒提供材料來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和宿主菌 p ETHD質(zhì)粒由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)，含有ORF5編碼區(qū)基因。表達(dá)載體PET－30a購(gòu)自Novagen公司，克隆菌TG1，表達(dá)宿主菌BL21（DE3）本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)表達(dá)質(zhì)粒和HDAg編碼區(qū)設(shè)計(jì) 引 物，上游引物5′－CGCGGATCCCAT AT－GAGCCGCTCCGAATCGAGGAAACAT－3′ （含Bam H Ⅰ 酶 切 位 點(diǎn) ）， 下游引物 5′－CCCAAGCTTGCTAGCCCCGGGCGCTCCCCTCGAT－3′（Hin dⅢ酶切位點(diǎn)），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。

1.1.3 主要試劑 Bam HⅠ、Hin dⅢ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA ligase購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen；異丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自Sigma公司；丁型肝炎病毒（HDV）陽性血清、陰性血清，人免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒 （HAV）、甲型肝 炎病毒（HCV）、成型肝炎病毒（HEV）陽性血清，抗人Ig M（μ鏈）單克隆抗體，由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 建立30μL PCR反應(yīng)體系（20×buffer，1.5μL；MgCl2，0.6μL；d NTP，0.3μL；上游引物，0.2μL；下游引物，0.2μL；DNA 聚合酶，0.3μL；p ETHD，0.5μL ；dd H2O，26.4μL），反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃5 min。得到HDAg基因片段，預(yù)期擴(kuò)增片段500 bp，用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、Hin dⅢ分別酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET－30a，15 g／L瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶，用DNA膠回收試劑盒回收目的條帶和載體片段。T4連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌TG1中，涂LB平板（含Kana 30 mg／L），37℃過夜培養(yǎng)，挑取 LB平板上單個(gè)菌落做菌落PCR。挑取菌落PCR陽性的菌落培養(yǎng)18 h后提取質(zhì)粒，Bam HⅠ、Hin dⅢ雙酶切鑒定。酶切正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 HDAg的小量原核表達(dá)條件優(yōu)化 將測(cè)序正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞BL21（DE3）中，涂LB平板（含Kana 30 mg／L）。從平板上挑取單菌落，接種于3.5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含 Kana 30 mg／L），37℃搖床培養(yǎng)12 h。取菌液100μL轉(zhuǎn)接3.5 mL LB培養(yǎng)基中（含Kana 30 mg／L）。當(dāng)培養(yǎng)至 OD600 nm約為0.3～0.5，分別加入IPTG至其終濃度為0.05、0.1、0.2 mmol／L，另取一支不加IPTG，作為對(duì)照，37℃振蕩培養(yǎng)4 h，隨后取1.0 mL菌液以1 200 r／min破碎離心2 min，離心后取上清和沉淀加上樣緩沖液進(jìn)行SDS－PAGE，確定最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。在3.5 mL培養(yǎng)基中加入IPTG至最佳誘導(dǎo)濃度，于37℃振蕩培養(yǎng)，取不同時(shí)間段（誘導(dǎo)表達(dá)2、4、6、8 h）的表達(dá)產(chǎn)物各1.0 mL以1 200 r／min破碎離心2 min，離心后取上清和沉淀加上樣緩沖液進(jìn)行SDS－PAGE。最后在最佳誘導(dǎo)濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間確定后，分別于25、30、37℃不同溫度誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物各1.0 mL以1 200 r／min破碎離心2 min，離心后取上清和沉淀加上樣緩沖液進(jìn)行SDS－PAGE。

1.2.3 HDAg的大量誘導(dǎo)表達(dá) 按照優(yōu)化最佳誘導(dǎo)條件，取穩(wěn)定表達(dá)的菌液500μL接于500 mL LB液體培養(yǎng)基（含 Kana 30 mg／L），進(jìn)行大樣誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌液，8 000 r／min離心10 min，棄培養(yǎng)液，加入0.05 mmol／L PB洗滌沉淀，8000 r／min離心10 min，棄上清，收集沉淀液于－20℃凍存。

1.2.4 HDAg的制備及純化 將凍存的菌液用0.05 mmol／L PB溶解，在冰浴條件下超聲波破碎，將破碎的菌液以8 000 r／min離心10 min，取上清，用飽和硫酸銨沉淀，至終濃度為400 mL／L。將沉淀液以8 000 r／min離心10 min。棄上清，留沉淀，用去離子水透析過夜除去硫酸銨，再用4 mol／L尿素溶解，將溶液按照Ni－NTA親和層析柱產(chǎn)品使用說明純化蛋白。

1.2.5 方陣滴定法確定最佳酶標(biāo)抗原濃度 對(duì)純化的抗原進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記（改良過碘酸鈉法），作為酶標(biāo)抗原 HRP－HDAg，按照 1／500、1／1 000、1／1 500、1／2 000進(jìn)行稀釋，用0.05 mol／L p H 9.5～9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋抗人Ig M（μ鏈）單克隆抗體200、100、50 ng／100μL包被聚苯乙烯板。采用方陣滴定法確定單抗最佳包被濃度和酶標(biāo)最佳稀釋度。

1.2.6 陰陽性判定 用建立捕獲法，根據(jù)ELISA檢測(cè)方法臨界值（Cut off）的經(jīng)驗(yàn)公式：臨界值＝2.1×陰性對(duì)照孔吸光度值均值；通過對(duì)15例病理樣本的檢測(cè)，檢驗(yàn)參考值的合理性。

1.2.7 交叉反應(yīng)試驗(yàn) 用建立的捕獲法分別與HIV、HAV、HCV、HEV陽性血清反應(yīng)（血清經(jīng)醫(yī)院檢測(cè)HDV為陰性，使用前已經(jīng)滅活），同時(shí)選取HDV陽性血清和陰性血清作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，每孔做復(fù)孔 。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒構(gòu)建

應(yīng)用PCR方法從pETHD質(zhì)粒中擴(kuò)增到約500 bp的DNA條帶，片段與預(yù)期設(shè)計(jì)相符（圖1）。將回收片段連接于pET－30a表達(dá)質(zhì)粒，獲得pET－30a／HDAg重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)轉(zhuǎn)化TG1宿主菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行Bam HⅠ、Hin dⅢ 雙酶切鑒定（圖2）。

2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

SDS－PAGE顯示IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol／L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6 h，最佳誘導(dǎo)溫度為37℃。表達(dá)產(chǎn)物大小約為27 ku，與設(shè)計(jì)相符。此條件下目的蛋白表達(dá)量最大，在上清和沉淀中均有蛋白HDAg，掃描分析上清表達(dá)量占總體電泳蛋白條帶的25%左右（圖3）。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物純化及SDS－PAGE電泳分析

從SDS－PAGE電泳結(jié)果可以看到，經(jīng)過20 mmol／L咪唑洗脫收集的目的蛋白含有少許雜蛋白；經(jīng)過50 mmol／L咪唑洗脫收集的蛋白純度較高，含量較高。掃描分析其純度可達(dá)95%以上（圖4）。

2.4 方陣滴定法確定最佳酶標(biāo)抗原濃度和抗體包被濃度

通過方陣滴定包被抗體最佳工作濃度為100 ng和酶標(biāo)抗原工作濃度為1／1 000組合時(shí)，P／N比值最大（表1）。

表1 包被單抗和酶標(biāo)抗原的確定Table1 Determination for optimal concentration of Mc Ab and HRP－HDAg

2.5 陰陽性判定

根據(jù)酶免檢測(cè)方法臨界值（Cut off）的經(jīng)驗(yàn)公式：臨界值＝2.1×陰性對(duì)照孔吸光度值均值。當(dāng)陰性對(duì)照吸光度值均值小于0.05以0.05計(jì)算；當(dāng)陰性對(duì)照吸光度值大于等于0.05以實(shí)際值計(jì)算。一般陰性對(duì)照吸光度值均值小于0.05（參照表1，陰性均值），因此確定陰性血清HDV Ig M正常值上限為0.105。檢測(cè)值低于0.105判為陰性，檢測(cè)值高于0.105判為陽性，通過對(duì)15例病理樣本的檢測(cè)，均在0.2以上。

2.6 交叉反應(yīng)試驗(yàn)

用建立的捕獲法分別與 HIV、HAV、HCV、HEV陽性血清反應(yīng)，結(jié)果均為陰性，說明表達(dá)的HDAg對(duì)丁型肝炎病毒Ig M具有特異性（表2）。

表2 交叉反應(yīng)結(jié)果Table2 The results of cross－reaction

3 討論

目前利用基因工程表達(dá)HDAg已有不少報(bào)道［8－10］，表達(dá)的抗原編碼區(qū)基因在230 bp～680 bp之間，表達(dá)蛋白以融合蛋白［9］或包涵體［10］形式存在，蛋白純度達(dá)到90%，均具有抗原性［11］。本研究擴(kuò)增編碼區(qū)500 bp，與p ET－30a載體連接，重組表達(dá)質(zhì)粒pET－30a／HDAg，經(jīng)轉(zhuǎn)化 BL21（DE3）誘導(dǎo)，經(jīng)SDSPAGE分析，蛋白分子質(zhì)量為27 ku，蛋白在破碎后菌液上清和沉淀中均有。選擇上清溶液用400 g／L過硫酸銨沉淀目的蛋白，后用Ni－NTA親和層析純化，蛋白的純度達(dá)到95%以上，通過ELISA和交叉反應(yīng)試驗(yàn)，表明反應(yīng)原性和特異性較高。

p ET－30a中的S·Tag標(biāo)簽是高度可溶的多肽，可增強(qiáng)一些蛋白的可溶性，并且p ET－30a在N端編碼6個(gè)連續(xù)的His－Tag作為親和臂（Affinity－Tag），使所得的重組蛋白能通過金屬離子（Ni2＋）配體親和層析快速純化。

目前對(duì)于丁型肝炎病毒的檢測(cè)有PCR法、分子雜交法和ELISA法，前兩種方法主要是檢測(cè)HDVRNA，目前對(duì)此尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。ELISA主要是檢測(cè)Ig M和IgG，IgG在丁型肝炎病毒感染后可檢出，Ig M抗體在丁型肝炎病毒早期感染可檢出。對(duì)HDV感染尚無特效治療藥物，切斷HDV的傳播途徑是主要預(yù)防措施之一，早期診斷對(duì)HDV感染的預(yù)防和控制有著重要意義。謝立等［12］對(duì)表達(dá)的抗原進(jìn)行HRP標(biāo)記，檢測(cè)丁型肝炎病毒Ig M抗體，靈敏度高，特異性好。本研究利用表達(dá)的抗原初步建立捕獲法，通過方陣滴定確定包被抗人Ig M（μ鏈）單克隆抗體最佳工作濃度為100 ng和HRP－HDAg工作濃度為1／1 000組合時(shí)，P／N比值最大，通過交叉反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果表明，表達(dá)的抗原具有很好的反應(yīng)原性和特異性，可為建立丁型肝炎病毒早期檢測(cè)試劑盒提供材料來源。

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