鄧顯文，謝芝勛，謝麗基，謝志勤，劉加波，龐耀珊，彭 宜，范 晴

（廣西獸醫(yī)研究所，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

腸炎沙門菌是目前引起人類食物中毒的主要病原之一，其感染主要是因食用了被腸炎沙門菌污染的動(dòng)物性食品，尤其是家禽的肉蛋食品，近年來，腸炎沙門菌食物中毒和動(dòng)物感染腸炎沙門菌十分嚴(yán)重，已引起養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生界的高度重視［1－4］。目前應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)SE的檢測(cè)已有報(bào)道［5－9］，PCR檢測(cè)方法雖然快速、敏感性較高，但是需要使用昂貴的儀器和試劑等，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)具有簡捷、成本低廉和結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)，目前在一些病原微生物的檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用［10－11］。本試驗(yàn)用SE種特異的 DNA 序列（Salmonella difference fragment，SdfⅠ）構(gòu)建LAMP方法檢測(cè)腸炎沙門菌，為臨床檢測(cè)腸炎沙門菌的感染調(diào)查奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的腸炎沙門菌（SE28、SE29、SE30、SE75、SE90、SE221、SE635）、傷寒沙門菌（S.typhi）、副傷寒沙門菌（S.parutyphi）、雞沙門菌（S.pullerium）由美國康州大學(xué)Khan教授惠贈(zèng)，雞沙門菌（CVCC533）、馬流產(chǎn)沙門菌（CVCC514）、腸炎沙門菌（CVCC2182、CVCC2183、CVCC2184）、豬霍亂沙門菌（CVCC2179）、傷寒沙門菌（CVCC2213）、雷丁沙門菌（CVCC2210）、甲型副傷寒沙門菌（CVCC2189）、鼠傷寒沙門菌（CVCC2233）、腸炎沙門氏菌亞種（CVCC3374、CVCC3375、CVCC3376、CVCC3377、CVCC3378）由中國國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心購買，大腸埃希菌、葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、鏈球菌、愛德華菌、雞毒支原體、副雞嗜血桿菌均廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照Gen Bank中SE種特異的DNA 序 列 （Salmonella difference fragment ，SdfⅠ），利用Primer Exporer V4在線設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)LAMP引物，其中包括2條外引物SDF3／SDB3和2條內(nèi)引物SDFIP／SDBIP，以及2條用于提高擴(kuò)增效率的環(huán)引物SDBloop和SDFloop，在SDF1c、SDF2和SDB1c、SDB2之間分別添加Eco RⅠ酶切位點(diǎn)。引物由上海Invitrogen公司合成（表1）。

1.2.2 SE DNA的提取和模板的制備 DNA抽提：將菌株分別接種于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h至變混濁時(shí)，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌2次后，用適當(dāng)TE緩沖液懸浮沉淀，參照TIANgen DNA提取試劑盒說明書，其他對(duì)照菌（毒）株的DNA的抽提方法相同。

SE DNA模板的制備：用SDB3、SDF3引物PCR擴(kuò)增SE28 DNA，用凝膠回收試劑盒純化回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連入pGM－18 T載體，用PCR快速鑒定，陽性重組菌送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序，在GenBank中對(duì)序列進(jìn)行BLAST分析，驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。提取陽性重組菌質(zhì)粒，通過D260測(cè)定DNA濃度，置－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 擴(kuò)增SE的LAMP引物序列Table1 LAMP primers for amplifying SE

1.2.3 LAMP方法的優(yōu)化 反應(yīng)體系的建立：腸炎沙門菌LAMP的反應(yīng)體系為25μL，各組份的終濃度為SDF3和SDB3各0.2μmol／L、SDFIP和SDBIP各1.6μmol／L、SDFLoop和 SDBLoop各0.8μmol／L、10×bst polymerase buffer 2.5μL、d NTP 1.4 mmol／L、betaine 1 mmol／L、MgSO440 mmol／L、MnCl240 mmol／L、鈣黃綠素40 mmol／L、Bst DNA聚合酶8 U、模板1μL。

將溫度按58、60、62、64、65、67℃依次遞增，多次重復(fù)試驗(yàn)后確定最佳退火溫度。對(duì)反應(yīng)體系在如下范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化：Betaine（0.06 mol／L～0.2 mol／L）、MgSO4（1 mmol／L～6 mmol／L）、d NTP（0.4 mmol／L～1.6 mmol／L）

每次檢測(cè)時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照（健康組織的基因組DNA）；在陰性對(duì)照和陽性對(duì)照均成立時(shí)，整個(gè)試驗(yàn)有效，可判定結(jié)果。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 按照所建立的腸炎沙門菌LAMP 方 法，同 時(shí) 對(duì) SE28、SE29、SE30、SE75、SE90、SE221、SE635、S.typhi、S.Parutyphi、S.Pullerium， CVCC533、 CVCC514、 CVCC2182、CVCC2183、CVCC2184、CVCC2197、CVCC2213、CVCC2210、CVCC2189、CVCC2233、CVCC3374、CVCC3375、CVCC3376、CVCC3377、CVCC3378，Eco.l、葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、鏈球菌、愛德華菌、雞毒支原體、副雞嗜血桿菌等DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)，驗(yàn)證LAMP方法的特異性。取2μL LAMP反應(yīng)產(chǎn)物于20 g／L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 將SE28 DNA按10倍倍比稀釋至100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg和1 fg，用優(yōu)化好的LAMP方法和常規(guī)PCR方法同時(shí)檢測(cè)，進(jìn)而對(duì)兩者的敏感性進(jìn)行比較。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 提取等量6份不同的SE28株培養(yǎng)物的DNA，進(jìn)行LAMP檢測(cè)，在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 對(duì)采集的10份病料樣品進(jìn)行分離鑒定，并提取病料DAN進(jìn)行LAMP檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 通過對(duì)反應(yīng)溫度的優(yōu)化，最終確定該LAMP檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)溫度為63℃～65℃，加環(huán)引物反應(yīng)時(shí)間為50 min，未加環(huán)引物反應(yīng)時(shí)間為2.5 h。

2.1.2 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化 通過對(duì)各反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定LAMP反應(yīng)體系為25μL：Bst DNA聚合酶8 U、10×Bst buffer 2.5μL、d NTPs（10 mmol／L）3.5μL、Betaine（1 mol／L）5.0μL、MgSO4（25 mmol／L）4μL、FIP／BIP（20μmol／L）2 μL、B3／F3（20 μmol／L）0.25 μL、LF／LB（20 μmol／L）1μL、Calcein（625μmol／L）1μL、MnCl2（12.5 mmol／L）1μL、模板 DNA 1μL，加水至25 μL。充分混勻后，在水浴鍋中64℃反應(yīng)1 h，80℃作用10 min滅活。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

用建立的LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，只有腸炎沙門菌（SE28、SE29、SE30、SE75、SE90、SE221、SE635），腸炎沙門菌（CVCC2182、CVCC2183、CVCC2184）、腸 炎 沙 門 菌 亞 種 （CVCC3374、CVCC3375、CVCC3376、CVCC3377、CVCC3378）等15株腸炎沙門菌的DNA為陽性結(jié)果（肉眼觀察可見翠綠色，瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)特征性梯形條帶），而對(duì)傷寒沙門菌（S.typhi）、副傷寒沙門菌（S.parutyphi）、雞沙門菌（S.pullerium）、雞沙門菌（CVCC533）、馬流產(chǎn)沙門菌（CVCC514）、豬霍亂沙門菌（CVCC2179）、傷寒沙門菌（CVCC2213）、雷丁沙門菌（CVCC2210）、甲型副傷寒沙門菌（CVCC2189）、鼠傷寒沙門菌（CVCC2233）等10株其他沙門菌和其他細(xì)菌7株（大腸埃希菌、葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、鏈球菌、愛德華菌、雞毒支原體、副雞嗜血桿菌）的DNA檢測(cè)均為陰性（肉眼觀察可見桔紅色，均沒有特征性梯形條帶出現(xiàn)）。圖1中只有部分菌株，其余菌株圖略。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

所建立的LAMP對(duì)SE28 DNA的最小檢測(cè)限為100 fg（圖2），肉眼觀察可見翠綠色，瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)特征性梯形條帶，而常規(guī)PCR方法最小檢測(cè)限為10 pg（圖3），建立的LAMP敏感性比常規(guī)PCR高100倍。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)10份病料樣品抽提DNA后直接進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果有3份為陽性（圖4，肉眼觀察可見翠綠色，瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)特征性梯形條帶），與PCR及測(cè)序鑒定的結(jié)果一致。

3 討論

LAMP是一新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)克服了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的一些缺點(diǎn)，LAMP技術(shù)是一種簡便、快速、靈敏、成本低廉的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)在等溫條件下即可進(jìn)行核酸的變性和擴(kuò)增，不需要特殊的儀器設(shè)備，僅在水浴鍋中就可完成擴(kuò)增反應(yīng)［12］，并且反應(yīng)結(jié)果無需經(jīng)過電泳就可以直接觀察，肉眼可見陽性樣品的反應(yīng)液變成翠綠色，陰性樣品的反應(yīng)液則為桔紅色，因此應(yīng)用前景廣闊。

目前，國內(nèi)外均未見有建立SE LAMP可視化檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道，本研究在SE種特異的DNA序列（Salmonella difference fragment，SdfⅠ）的保守序列設(shè)計(jì)了針對(duì)8個(gè)特異區(qū)域的6條引物，使擴(kuò)增反應(yīng)具有很高的特異性，在內(nèi)引物之間增加兩條環(huán)引物提高了擴(kuò)增效率，縮短了LAMP的反應(yīng)時(shí)間。通過優(yōu)化反應(yīng)條件后，建立了SE的LAMP檢測(cè)方法。所建立的SE LAMP檢測(cè)方法只在水浴鍋中1 h即可完成能特異的檢測(cè)SE，對(duì)SE28等15株腸炎沙門菌的DNA檢測(cè)為陽性結(jié)果（肉眼觀察可見翠綠色），而對(duì)CVCC2210等10株其他沙門菌和大腸埃希菌等7株其他細(xì)菌的DNA檢測(cè)均為陰性（肉眼觀察可見桔紅色），并且檢測(cè)的靈敏度非常高，能檢測(cè)到100 fg的SE DNA樣品，靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，所建立的LAMP方法檢測(cè)腸炎沙門菌，為臨床檢測(cè)腸炎沙門菌的感染調(diào)查奠定基礎(chǔ)。

LAMP反應(yīng)具有較高的靈敏度，易受到反應(yīng)試劑、反應(yīng)器材及環(huán)境中污染的微量DNA模板而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，因此配制LAMP反應(yīng)體系時(shí)，應(yīng)將配制反應(yīng)體系的區(qū)域、加樣區(qū)域與觀察反應(yīng)結(jié)果的區(qū)域進(jìn)行嚴(yán)格分區(qū)，防止假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。常規(guī)的LAMP方法，需要在反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green或Gene Finder染料顯色，反應(yīng)產(chǎn)物易形成氣溶膠污染環(huán)境而造成假陽性，同時(shí)SYBR Green或Gene Finder染料還會(huì)因?yàn)橐锒垠w而引起假陽性。因此，本研究使用Calcein＋MnCl2替代了SYBR Green和 Gene Finder，在配制 LAMP反應(yīng)液時(shí)就可以加入反應(yīng)液中，并且Calcein＋MnCl2僅在發(fā)生LAMP反應(yīng)時(shí)才呈現(xiàn)翠綠色，避免了SYBR Green和Gene Finder染料造成的假陽性問題，具有更好的特異性。

建立的SE LAMP檢測(cè)方法具有快速、靈敏、特異、簡便的特點(diǎn)，僅需使用一臺(tái)能控溫的水浴鍋，并且結(jié)果可以無需儀器而僅通過肉眼判定，適合在邊境口岸、食品廠、基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場(chǎng)中進(jìn)行快速檢測(cè)，因此用LAMP快速檢測(cè)SE，對(duì)SE的有效防控有重要意義，具有較好的應(yīng)用前景。

［1］王章云.腸炎沙門氏菌引起的食物中毒細(xì)菌學(xué)調(diào)查［J］.中國人獸共患病雜志，1999，15（3）：115.

［2］杜秀珍雛.雞和雞蛋腸炎沙門氏氏菌的檢測(cè)與控制研究進(jìn)展［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，1997（5）：17－18.

［3］李繼祥，高繼業(yè)，唐 妤，等.屠宰場(chǎng)生雞肉腸炎沙門氏菌的污染途徑［J］.食品科學(xué)，2010，31（15）：208－211.

［4］王 亮，張?jiān)i，張榮武，等.雞源性腸炎沙門氏菌的流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2011，27（5）：455－458.

［5］蔣 穎，劉 軼，酈曉瓊，等.腸炎沙門氏菌特異性診斷方法的建立［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與牛命科學(xué)版，2007，28（3）：6－7.

［6］陳弟詩，郭萬柱，徐志文，等.豬霍亂沙門氏菌的分離與鑒定以及PCR檢測(cè)方法的建立［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（20）：6020－6023.

［7］Rescigno M，Urbano M，Valzasina B，et al.Dendritic cells express tight junction proteins and penetrate gut epithelial monolayers to sample bacteria［J］.Immnology，2001，2（4）：361－367.

［8］Deng S X，Cheng A C，Wang M S，et al.Study on the gastrointestinal tract distribution of Salmonella enteritidis in orally infected mice with a species－specific fluorescent quantitative polymerase chain reaction ［J］.World J Gastroenterol，2007，13：6568－6574.

［9］Agron P G，Walker R L，Kinde H，et al.Identification by subtractive hybridization of sequences specific for Salmonella enterica serovar enteritidis ［J］.Appl Environ Microbiol，2001，61（11）：4984－4991.

［10］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop－mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：e63.

［11］彭 宜，謝芝勛，劉加波，等.H9亞型禽流感病毒RT－LAMP可視化檢測(cè)方法的建立［J］.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2011，27（1）：19－22.

［12］范 晴，謝芝勛，劉加波，等.牛病毒性腹瀉病毒RT－LAMP檢測(cè)方法的建立［J］.生物技術(shù)通訊，2010，21（2）：248－251.

［13］He L，Zhou Y Q，Oosthuizen M C，et al.Loop－mediated isothermal amplification（LAMP）detection of Babesia orientalis in water buffalo（Bubalus babalis，Linnaeus，1758）in China［J］.Vet Parasitol，2009，165（1－2）：36－40.

［14］葉朗光，鄧樹軒.腸炎沙門氏菌研究進(jìn)展［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2011，32（2）：121－122.

［15］朱春紅，吳 娟，張偉娟，等.腸炎沙門氏菌SEFA基因表達(dá)和間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32（1）：44－48.